Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 6:52 min. • June 17th, 2025
Coloque uma amostra de tecido cerebral de camundongo e padrões em uma câmara de ablação a laser.
Os padrões contêm concentrações conhecidas de metais enriquecidos em homogeneizados de tecido cerebral de cordeiro.
Encha a câmara com gás argônio e concentre um feixe de laser ultravioleta no tecido.
O laser vaporiza a amostra e os padrões em um padrão linear, criando um aerossol de partículas finas.
O gás argônio transporta as partículas para o plasma indutivamente acoplado, uma fonte de ionização de alta temperatura.
O plasma atomiza e ioniza as partículas em íons carregados positivamente.
Os íons entram no espectrômetro de massa e são separados com base em suas proporções massa-carga.
Os dados resultantes são comparados a um banco de dados de referência para identificar os metais presentes na amostra. A partir dos padrões, uma curva de calibração é gerada.
Calcule as concentrações de metais na amostra calibrando suas intensidades de sinal em relação às dos padrões, revelando a distribuição espacial dos metais dentro da fatia do cérebro.
Primeiro, coloque uma amostra de tecido cerebral e todos os padrões de tecido correspondentes à matriz na câmara de ablação a laser. Certifique-se de que as amostras estejam dentro da profundidade de campo da câmera LACCD. Feche a porta da câmara e aperte os parafusos com os dedos.
Em seguida, no software ICP-MS, abra a válvula de gás de arraste e ajuste a vazão para 1,2 litros por minuto. No software LA, execute uma purga de 30 minutos da célula de ablação com o gás de arraste para uma célula de ablação de 2 volumes. A cada 10 minutos, mova o estágio de amostra para cada canto da câmara para reduzir a quantidade de ar residual na célula.
Ligue o ICP-MS e deixe o instrumento aquecer por duas horas. Enquanto o instrumento está aquecendo, no software de ablação a laser, desenhe uma linha de ablação de aproximadamente 3 milímetros de comprimento na superfície do primeiro padrão de tecido. Clique na linha de ablação e defina o diâmetro do feixe padrão, a velocidade de varredura e a fluência radiante. Duplique a linha seis vezes, espaçando as linhas pelo diâmetro do feixe. Repita esse processo para cada padrão.
Em seguida, use a ferramenta Linha para desenhar a área de ablação sobre a amostra do canto superior esquerdo até o ponto mais largo da amostra, usando os mesmos parâmetros dos padrões.
Duplique a linha conforme necessário para cobertura completa da amostra com o mesmo espaçamento usado nas normas. Em seguida, desenhe um conjunto de linhas para varredura intermitente de padrões o mais tardar após 20 horas de varredura da amostra ou entre cada amostra. Adicione uma varredura dos padrões ao final do experimento.
Com base no comprimento da linha e na velocidade de varredura, determine o tempo de análise para a amostra e as linhas padrão. Em seguida, crie um novo lote no software ICP-MS e selecione Análise resolvida no tempo. Escolha os valores de proporção de massa para carga de interesse e defina os tempos de integração para cada proporção, de modo que o tempo total de integração para um ciclo seja de 0,25 segundos. Salve o lote.
Para um lote padrão, preencha o tempo de análise para cada linha com um buffer adicional de 15 segundos para levar em conta os tempos de aquecimento e lavagem do laser. Definir uma lista de repetições de amostra com uma aquisição para cada linha standard. Para o lote de amostra, duplique o lote padrão e ajuste os tempos e o número de aquisições de acordo com o padrão de ablação da amostra.
Depois que o ICP-MS estiver aquecido, adicione o primeiro lote à fila e certifique-se de que o software esteja aguardando um disparo do instrumento LA. Em seguida, no software LA, ligue a fonte de alimentação do laser e defina os tempos de aquecimento e lavagem do laser. Inicie a sequência de laser e verifique se o ICP-MS inicia corretamente a coleta de dados após a ablação.
Depois que os dados forem coletados, extraia os dados para os padrões dos arquivos CSV. Execute a subtração da linha de base e exclua o sinal de fundo. Identifique quedas de sinal causadas por orifícios nos padrões de tecido.
Mascare essas áreas de baixo sinal e exporte os dados como uma planilha. Calcule um fator de conversão de CPS para PPM para cada elemento identificado. Repita esse processo para cada padrão.
Em seguida, abra o software de construção de imagens quantitativas e importe os dados de amostra dos arquivos CSV. Selecione várias áreas do plano de fundo para aplicar a correção do plano de fundo. Selecione a ferramenta de edição de gráfico, clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione Modificar aparência da imagem. Altere a primeira cor em Z para um grande valor negativo.
E clique em Concluído para aprimorar o sinal de fundo. Em seguida, na guia Padrões, insira os fatores de correção do CPS PPM para cada padrão e clique em Ir. Abra o Navegador de Dados na guia Dados, clique com o botão direito do mouse em um arquivo de imagem corrigido e clique em Nova imagem.
Abra a janela Modificar aparência da imagem e defina a tabela de cores e a escala. Use o utilitário Adicionar anotação para colocar uma escala de cores na imagem. Ajuste a escala de cores na janela de escala de cores. Depois que a imagem for colorida e anotada, copie e cole a imagem em outro programa ou exporte a imagem do software de construção de imagens.
Para ativar as ferramentas de ROI, selecione Processamento de imagem nos pacotes de análise e escolha uma imagem. Na guia Imagem, clique em ROI e inicie o ROI Draw. Selecione a região de interesse e clique em Concluir ROI.
Na guia Imagem, clique em Estatísticas para obter os dados de ROI. Copie e cole os dados em uma planilha, certificando-se de salvar quando cada ROI for adicionado. Repita o processo conforme necessário.