JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:15 min • June 17th, 2025
Comece com um explante de retina de camundongo pós-natal vivo montado em um filtro de membrana e colocado em uma câmara de incubação sob um microscópio confocal.
A retina é transfectada para expressar uma proteína fluorescente nas membranas dos interneurônios amácrinos starburst.
Coloque um peso de amostra pré-umedecido na retina para estabilizá-la.
Encha a câmara com tampão.
Mantenha o fluxo e a temperatura ideais do tampão na câmara para preservar a viabilidade neuronal.
Posicione uma objetiva de imersão em água na câmara de imagem.
Inicie a imagem de epifluorescência.
A luz do laser, direcionada através da objetiva, excita a proteína fluorescente nas células amácrinas.
A fluorescência emitida é captada através da mesma objetiva, permitindo a visualização das células amácrinas marcadas.
Identifique uma célula fluorescente brilhante para geração de imagens.
Defina os parâmetros de imagem.
Capture imagens em vários planos Z para obter uma visualização 3D da morfologia dendrítica completa.
Realize imagens de lapso de tempo para rastrear mudanças na morfologia dendrítica ao longo do tempo.
Monte a câmara de incubação de imagem ao vivo e encha-a com aCSF oxigenado. Ligue a bomba e o controlador de temperatura, certificando-se de que a temperatura não suba acima de 34 graus Celsius. Pode levar até uma hora para que a temperatura da câmara se estabilize. Recomenda-se configurar a câmara de incubação antes de iniciar a dissecção da retina. A temperatura estável da câmara ajuda a reduzir o desvio da amostra.
Para transferir o monte plano da retina para a câmara de perfusão, pare a bomba e remova o aCSF que está na câmara. Em seguida, coloque o disco MCE com a montagem plana da retina na câmara de incubação. Umedeça previamente um peso de amostra para quebrar a tensão superficial e, em seguida, coloque-o no monte plano, garantindo que o peso da amostra seja colocado no papel MCE para reduzir o desvio da amostra. Reabasteça a câmara com o aCSF aquecido e circule o aCSF a aproximadamente 1 mililitro por minuto.
Posicione a peça do nariz com a objetiva de imersão de água 25 vezes na câmara de imagem. Faça a triagem de células marcadas de interesse usando luz epifluorescente e ajuste o volume da imagem para capturar características dendríticas de interesse.
Usando uma tabela de pesquisa que identifica pixels supersaturados e subsaturados, ajuste a potência do laser de forma que nenhum pixel fique supersaturado. Adquira o volume de imagem 3D e repita a aquisição na taxa de quadros desejada. O volume de imagem pode ser ajustado entre cada ponto de tempo para compensar o desvio da amostra.