Microinjeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação gênica em um filhote de camundongo estriado

Pegue um filhote de camundongo geneticamente modificado carregando um STOP flanqueado por loxP que bloqueia a proteína fluorescente vermelha ou a expressão de RFP.

Prenda o filhote em uma estrutura estereotáxica feita sob medida e cubra-o com gelo para manter a anestesia.

Desinfete o couro cabeludo e marque lambda como ponto de referência.

Alinhe a agulha de injeção às coordenadas estriatais em relação ao lambda e perfure o crânio.

Retraia a agulha para a superfície do crânio e insira-a na profundidade do alvo.

Injete o vetor viral misturado com corante no estriado a uma taxa controlada. O vetor codifica proteínas fluorescentes verdes ou GFPs e Cre recombinase.

Retire a agulha lentamente para evitar o refluxo da solução.

Remova o filhote e permita a recuperação.

Nas células estriadas, o vírus libera seu genoma, possibilitando a expressão de Cre recombinase e GFP. Cre retira o STOP ladeado por loxP, ativando a expressão RFP.

A expressão simultânea de GFP e RFP confirma a manipulação gênica bem-sucedida.

Posicione o filhote com a luva na bandeja da cabeça e coloque um pouco de gelo picado ao redor da manga de látex para manter a anestesia da hipotermia. Em seguida, esfregue a cabeça do filhote com etanol 70% e localize o ponto de referência lambda. Marque-o com um marcador. Em seguida, aponte a ponta da agulha para o lambda e defina as coordenadas laterais anterior, posterior e medial como zero.

Em seguida, consultando um atlas cerebral, mova o braço de injeção para o local alvo. Por exemplo, o estriado de filhotes P2 é 2,4 milímetros anterior ao lambda, 1,0 milímetros de cada lado da linha média e 1,7 milímetros ventral. Em seguida, marque a posição do corante verde rápido no tubo PE10 usando uma caneta. Em seguida, comece lentamente a penetrar a agulha através da pele e do crânio até que a ponta da agulha entre em contato com a superfície do crânio.

Defina a coordenada ventral dorsal como zero. Em seguida, abaixe a agulha lentamente até o local de destino. Uma vez na posição, aguarde um minuto para permitir que o parênquima retorne à sua forma normal. Em seguida, execute o programa de microinjeção a 100 nanolitros por minuto. Durante a injeção, observe o corante verde rápido se mover na tubulação de PE.

É fundamental penetrar lentamente a agulha através da pele e do crânio até que a ponta da agulha entre em contato com a superfície do crânio. Durante a injeção, é imperativo observar o corante Fast Green se mover no tubo de PE.

Após a conclusão da injeção, aguarde um minuto e, em seguida, levante lentamente a agulha até metade da profundidade do DV penetrado. Em seguida, espere mais 30 segundos antes de prosseguir com a retirada lenta da agulha da cabeça do filhote.

Após a conclusão da injeção, é importante esperar um minuto antes de levar lentamente a agulha até a metade da profundidade do DV penetrado e, em seguida, esperar mais 30 segundos antes de retirar lentamente a agulha da cabeça do filhote.

Depois que todos os locais-alvo forem injetados, aqueça o filhote por 20 minutos em uma incubadora de 33 graus Celsius.

Verifique o filhote a cada cinco minutos até que ele recupere a decúbito esternal. Em seguida, devolva o filhote à sua mãe.