Name: A manipulação experimental de tamanho do corpo para Estimar Relacionamentos Scaling morfológicas em Drosophila /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprenda a manipular a disponibilidade de alimentos em Drosophila para criar variação de tamanho corporal e estimar relações de escala morfológica entre tamanho do corpo e asa. Este método auxilia pesquisadores em biologia evolutiva.

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A pesquisa descrita neste estudo foi apoiado por uma bolsa da National Science Foundation (DEB-0805818) para WAF, AWS e ID Este estudo foi também apoiado por doações IOS-0845847 a AWS, IOS-0919855 para AWS e ID e IOS-0920720 para WAF

1. Criação e manipulação da dieta para produzir variação no tamanho do corpo e da asa tamanho Racional e Visão. A expressão das relações de escala em última análise, depende da regulamentação processos de desenvolvimento que produzem variação no órgão final e tamanho do corpo. Estes processos são melhor descritos no trabalho de insetos totalmente metamórfica (ie, holometabolous), como D. melanogaster, onde órgãos crescer como indiferenciado "discos imaginais" dentro do grub-como larva 11,15-17. Em Drosophila, órgão final e tamanho do corpo são regulados pelo crescimento durante as fases larval; larvas crescem através do primeiro e segundo instar larval até atingirem um peso mínimo viável para a eclosão (MVW E) para o início do terceiro instar larval 18. Fome antes da realização MVW E impede a eclosão dos adultos. No entanto, as larvas que estão sedentos de MVW E gerar adultos viáveis, embora a um tamanho muito pequeno. Isto é porque reduziu a nutrição durante o desenvolvimento corporal final e reduz tamanho do órgão, e não apenas em moscas, mas em quase todos os animais 19-21. Ao manipular a disponibilidade de alimentos após MVW E é atingido, mas antes de pupação ocorre, é possível induzir extrema plasticidade fenotípica no tamanho do corpo que supera em muito outras fontes de variação (por exemplo, a variação genética individual). <ol><li> Os ovos são recolhidos junto da população a ser fenotipados, dividido em lotes de 50 e colocados em frascos contendo 10 ml de alimento voar padrão. Porque oviposição ocorre continuamente, os ovos são coletados a cada 24 horas durante três dias, produzindo três coortes de idade. </li><li> Quando o mais velho de coorte atinge o estágio errantes ou está apenas começando a pupate, a manipulação da dieta é aplicada. Neste ponto, a coorte mais velha é muito além do MVW E, o mais jovem de coorte é muito próximo do E MVW e da coorte restantes está em algum lugar entre esses extremos. Assim, a supressão dos alimentos neste momento irá produzir adultos muito grande a partir da coorte mais velha, adultos muito pequena da coorte mais jovem e de tamanho intermediário adultos da coorte de remanescentes. Para remover as larvas dos frascos, aproximadamente 5 ml de solução de sacarose 40% é adicionado a todos os frascos. Para liberar as larvas, a comida é agitada por 15-20 minutos em uma mesa shaker definida para uma velocidade intermediária. </li><li> Larvas flutuantes são removidos da solução de sacarose com um pincel (00) fina, colocados em frascos contendo um tampão de algodão molhado e permitiu a pupate. Alternativamente, as larvas podem ser colocados em um aditivo alimentar não digeríveis, como metil-celulose 22. </li></ol> 2. Estimativa do tamanho do corpo Racional e Visão. Estudos anteriores indicam que o comprimento do tórax é um menos de procuração ideal para o tamanho total do corpo 22. Em vez disso, usamos tamanho pupal como uma medida de tamanho do corpo. Tamanho corporal máximo é fixado a cessação da alimentação que antecede a pupação. Como resultado, há uma estreita correlação entre o tamanho da pupa e adulto tamanho corpo 23. <ol><li> Pupas são dispostas lado ventral para cima em lâminas de vidro para microscópio e fotografada usando uma câmera digital acoplada a um microscópio de dissecação. Cada imagem é capturada, atribuído um código de identificação único e transferidos para um computador através de uma transmissão ao vivo de conectar a câmera digital para o computador. </li><li> Pupas com imagens são movidas para cada 2 ml contendo 1ml epitubes de alimentos voar, identificado com o código único para cada indivíduo, e puncionada com respiradouro para permitir a troca de gás. </li><li> Tamanho pupal é estimado como o número de pixels da silhueta pupal. Métricas de outro tamanho também pode ser usado. </li></ol> 3. Traço estimativa do tamanho (asa) Racional e Visão. Para asas de imagem, usamos uma 'asa grabber' 24, que puxa e prende a asa de um viver perpendicular voar, anestesiados ao seu corpo. Pressionado entre dois pedaços de vidro, isto permite que a asa a ser trabalhada como um objeto bidimensional. <ol><li> Moscas são anestesiados levemente com CO 2 e colocado em posição no grabber asa em um microscópio de dissecação equipado com uma câmera digital que é conectado a um computador. </li><li> A ala é fotografada e guardada sob o código único para cada indivíduo. </li><li> Tamanho da asa pode ser estimada utilizando o polígono convexo mínimo que circunscreve marginal marcos fixo ou como a contagem de pixels da silhueta da asa. </li></ol> 4. Estimativa de relação de escala <ol><li> Os dados são partilhados com outras gerações, mas separadas por sexo e log-transformada. </li><li> Relações de escala estão aptos para os dados de tamanho usando Tipo II (ou seja, redução do Eixo Maior) de regressão (ver revisão em 12) e os parâmetros estimados para cada grupo. </li></ol> 5. Resultados representativos: tenda "&gt; Nossa manipulação da dieta irá produzir uma ampla gama de tamanhos de corpo (Figura 1) e tamanhos traço (Figura 2). Plotagem os traços log transformados uns contra os outros revela seu padrão de covariação dentro de um determinado grupo biológico e permite ajustar a relação de escala para o grupo (Figura 3). extração dos parâmetros relação de escala que descrevem como escalas forma com o tamanho do corpo permite a comparação de covaries como a forma com tamanho entre os grupos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg"> Figura 1. Pupa dos extremos da distribuição de tamanho produzido através de manipulação de dieta após indivíduos alcançar o E MVW. Imagens reais pupal são mostrados à esquerda com suas silhuetas correspondente para a medição do tamanho pupal à direita. Barra de escala é de 1mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg"> Asas figura 2. Tirado extremos da distribuição de tamanho corporal produzida por meio de manipulação da dieta após indivíduos alcançar o E MVW. Imagens ala real são mostrados à esquerda com suas silhuetas correspondente para a medição do tamanho da asa mostrado à direita. Barra de escala é de 1mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg"> Figura 3. Asa-corpo de escala de tamanho de Drosophila melanogaster por sexo. Dados log-transformados para os indivíduos de cada sexo, que foram totalmente alimentado (círculos escuros), uma fome (círculos cinza) ou dois dias (círculos abertos), como larvas. Tipo de linha de regressão II é mostrado para cada sexo. Entre cada faixa etária, o declínio na área de asa média de 0,1 milímetros ~ (~ 7%) e ~ 0,2 milímetros (~ 8%) ocorre, aumentando a gama total de fenótipos observados. As regressões revelam que as fêmeas são ligeiramente hypoallometric para esta relação de escala (inclinação de 0,96), enquanto os machos são ligeiramente hyperallometric (inclinação 1,06).

<ol><li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmidt-Nielsen%2C+K+%22Scaling%3A+Why+is+animal+size+so+important%22">Scaling: Why is animal size so important</a>. , Cambridge University Press. (1984).</li>
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<li>Stieper, B. C., Kupershtok, M., Driscoll, M. V., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+regulate+developmental+timing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs regulate developmental timing in Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 321, 18-26 (2008).</li>
<li>Colombani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li>
<li>Mirth, C. K., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+assessment+and+growth+control%3A+How+adult+size+is+determined+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Size assessment and growth control: How adult size is determined in insects.</a> BioEssays. 29, 344-355 (2007).</li>
<li>Thissen, J. P., Ketelslegers, J. M., Underwood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+regulation+of+the+insulin-like+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nutritional regulation of the insulin-like growth factors.</a> Endocr. Rev. 15, 80-101 (1994).</li>
<li>Boots, M., Begon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+limitation+and+the+lethal+and+sublethal+effects+of+a+viral+pathogen+in+the+Indian+meal+moth%2C+Plodia+interpunctella%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Resource limitation and the lethal and sublethal effects of a viral pathogen in the Indian meal moth, Plodia interpunctella.</a> Ecol. Entomol. 19, 319-326 (1994).</li>
<li>Shingleton, A. W., Mirth, C. K., Bates, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+model+of+static+allometry+in+holometabolous+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Developmental model of static allometry in holometabolous insects.</a> Proc. R. Soc. B. 275, 1875-1885 (2008).</li>
<li>Stern, D. L., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+basis+of+allometry+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The developmental basis of allometry in insects.</a> Development. 126, 1091-1101 (1999).</li>
<li>Emlen, D. J., Allen, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+to+phenotype%3A+Physiological+control+of+trait+size+and+scaling+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Comp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotype to phenotype: Physiological control of trait size and scaling in insects.</a> Integr. Comp. Biol. 43, 617-634 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Escala morfológica tem sido objeto de intenso estudo em biologia evolutiva por quase um século. Mais recentemente, a base próxima da regulação do crescimento e ampliação tornou-se cada vez mais importante no desenvolvimento, fisiologia e genética (por exemplo, visualizar em 12,15,23-25). Nossa metodologia permite estimar relações de escala morfológica em toda a gama de traço e tamanhos de corpo. Isso pode ser importante, como o tamanho do traço pode não escala linearmente com o tamanho do corpo (por exemplo, 13,14). No entanto, isso pode não ser aparente se os animais são criados somente sob condições de laboratório ideal. Embora o nosso protocolo foi desenvolvido explicitamente para permitir uma estimativa da relação de escala de asa-corpo tamanho em Drosophila, ele pode ser usado com o traço específico de modificação para estimar a relação de escala para qualquer característica morfológica em moscas. Da mesma forma, a manipulação da dieta pode provavelmente ser usado para produzir toda a gama de tamanhos de traço e corpo em outros insetos totalmente metamórfica; aplicações como simplesmente exigir saber quando o MVW E é atingida e aplicar a manipulação nesse ponto na ontogenia.

a manipulação experimental de tamanho do corpo para estimar relacionamentos scaling morfológicas em drosophila</em

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

O dimensionamento de partes do corpo é uma característica central da morfologia animais 1-7. Dentro da espécie, características morfológicas precisam ser corretamente proporcionada ao corpo para o organismo para funcionar; indivíduos maiores normalmente têm partes maiores do corpo e indivíduos menores geralmente têm partes menores do corpo, de modo que a forma do corpo em geral é mantida através de uma variedade de tamanhos de corpo adulto. A exigência de proporções corretas significa que os indivíduos dentro das espécies geralmente apresentam baixa variação no tamanho característica relativa. Em contraste, tamanho característica relativa pode variar drasticamente entre as espécies e é um mecanismo primário pelo qual a diversidade morfológica é produzido. Mais de um século de trabalho comparativo estabeleceu essas intra e interespecífica padrões de 3,4. Talvez a abordagem mais amplamente usado para descrever esta variação é calcular a relação de escala entre o tamanho de dois traços morfológicos, utilizando a equação alométrica y = bxα, onde x e y são do tamanho de dois traços, como órgão e tamanho do corpo 8 , 9. Esta equação descreve a relação intra-grupo de escala (por exemplo, espécies população,) entre dois traços que ambos variam em tamanho. Log-transformação desta equação produz uma simples equação linear, log (y) = log (b) + αlog (x) e log-log parcelas do tamanho de diferentes características entre os indivíduos da mesma espécie tipicamente revelam escala linear com intercepto de log (b) e uma inclinação de α, o chamado &quot;coeficiente alométrico &#39;9,10. Variação morfológica entre os grupos é descrito por diferenças na escala intercepta relacionamento ou pistas para um par de determinado traço. Conseqüentemente, a variação nos parâmetros da equação alométrica (b e α) elegantemente descreve a variação forma capturado no relacionamento entre órgãos e tamanho do corpo dentro e entre grupos biológicos (ver 11,12). Nem todos os traços de escala linearmente com o outro ou com o tamanho do corpo (por exemplo, 13,14) Assim, as relações de escala morfológicas são mais informativos quando os dados são retirados da vasta gama de tamanhos de traço. Aqui nós descrevemos como simples manipulação experimental da dieta pode ser usado para produzir toda a gama de tamanho do corpo dos insetos. Isto permite uma estimativa da relação de escala total para um dado par de características, permitindo uma descrição completa de covaries como a forma com o tamanho e uma comparação robusto de parâmetros de escala do relacionamento entre os grupos biológicos. Embora nos concentremos em Drosophila, nossa metodologia deve ser aplicado a quase qualquer inseto totalmente metamórfica.

Relações de escala morfológica captar e descrever a forma do organismo. Nós apresentamos um método para medir as relações de escala morfológica em toda a gama natural de tamanhos de corpo dos insetos totalmente metamórfica. Usando uma simples manipulação da dieta que aumentar a distribuição de tamanhos de traço, permitindo a descrição exata de como a forma e tamanho co-variar.

A manipulação experimental de tamanho do corpo para Estimar Relacionamentos Scaling morfológicas em Drosophila</em

O escalonamento das partes do corpo é uma característica central da morfologia animal1-7. Dentro de cada espécie, os traços morfológicos precisam estar corretamente proporcionados ao corpo...

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar uma manipulação cronometrada do desenvolvimento na disponibilidade de alimento para criar uma ampla variedade de tamanhos corporais, que então pode ser usada para estimar a relação de escala entre características morfológicas. Primeiro, ovos são coletados da mesma população de moscas durante três dias, criando três coortes etárias. Quando a coorte mais velha de larvas começa a empalidecer, larvas de todas as coortes são removidas do alimento.O resultado dessa modificação dietética é uma ampliação da variação no tamanho das pupas. Em seguida, são obtidas imagens das asas de pupas, ninfas e adultos de todos os indivíduos, permitindo a estimativa da relação de escala morfológica entre o tamanho do corpo e o tamanho das asas. Por fim, obtêm-se resultados que demonstram como o tamanho das asas escala com toda a faixa possível de tamanho corporal, ajustando uma regressão linear do tipo dois aos dados.Neste estudo, utilizamos uma manipulação temporal do desenvolvimento no acesso à nutrição para aumentar experimentalmente a variação no tamanho corporal entre moscas adultas. Isso nos permite estimar as relações de escala morfológica em toda a amplitude de tamanhos corporais. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a expressão e a evolução da escala morfológica, como a identificação da base imediata da variação nos parâmetros das relações de escala entre grupos biológicos.Transfira uma população de moscas para uma câmara de acasalamento e, em seguida, colete ovos a cada 24 horas durante três dias. Isso criará, ao final, três coortes etárias com a ajuda de um microscópio estereoscópico. Transfira lotes de 50 ovos de cada coorte para frascos contendo 10 mililitros de alimento padrão para moscas.Incube os frascos à temperatura desejada para o desenvolvimento das larvas. Quando o coorte mais velho atingir o estágio de erradia, é hora de aplicar a manipulação da dieta removendo as larvas do alimento. Neste ponto, as larvas do coorte mais velho já estão bem acima do peso viável mínimo para occlusão e estarão próximas do tamanho corporal máximo natural.Larvas do grupo intermediário ultrapassaram o peso viável mínimo, mas produzirão adultos menores do que larvas do grupo mais velho. Larvas do grupo mais jovem estão muito próximas do peso viável mínimo e, portanto, produzirão adultos muito pequenos. Para remover as larvas do alimento.Adicione aproximadamente cinco mililitros de solução de sacarose a 40% aos frascos e, em seguida, agite por 15 a 20 minutos em uma mesa agitadora em velocidade média. Após a agitação, remova as larvas flutuantes da solução de sacarose com um pincel fino e coloque-as, por coorte, em frascos contendo um tampão de algodão úmido para manter a umidade. Incube na temperatura desejada até que ocorra a pupação.Posicione as pupas sobre uma lâmina de microscópio com a face ventral voltada para cima. Uma vez que as pupas estejam posicionadas, capture imagens utilizando uma câmera digital acoplada ao microscópio. Certifique-se de configurar as configurações para que cada pupa apareça como uma silhueta escura sobre um fundo branco.Após a aquisição de imagens, transfira cada pupa para um tubo epit individual de dois mililitros contendo um mililitro de ração para moscas. Estime o tamanho da pupila como o número de pixels da silhueta da pupila. Outras métricas de tamanho, como comprimento ou largura, também podem ser utilizadas com o auxílio de um microscópio estereoscópico.Anestesie levemente a mosca usando dióxido de carbono e posicione-a com um segurador de asas, um dispositivo de sucção que puxa a asa entre dois pedaços de vidro e a mantém perpendicular ao corpo da mosca. Para a obtenção de imagens, embora um segurador de asas seja usado para imagens das asas de moscas vivas neste estudo, asas e outros caracteres podem ser dissecados e analisados com ferramentas comuns. Capture a imagem da asa utilizando a câmera do microscópio conectada ao computador e anote o sexo da mosca. Após a imagem da asa ser capturada e salva, estime o tamanho da asa utilizando, alternativamente, o polígono convexo mínimo que circunscreve marcos fixos marginais como medidas lineares ou a contagem de pixels da silhueta da asa. Aqui, pupas imaginalizadas mostraram os extremos da distribuição de tamanho devido à manipulação da dieta.Após a pupa ter atingido o peso mínimo viável para inclusão. Também são mostradas as silhuetas correspondentes para a medição do tamanho da pupila. As imagens correspondentes das asas desses mesmos indivíduos nas extremidades da distribuição de tamanho são apresentadas aqui ao lado da silhueta.Utilizado para estimar a extração do tamanho da asa da relação de escala. Parâmetros que descrevem como o tamanho da asa escala com o tamanho do corpo permitem a comparação de como a forma geral co-varia com o tamanho entre grupos. Aqui, os dados são apresentados para indivíduos de cada sexo que foram totalmente alimentados ou privados de alimento por um ou dois dias durante a fase larval.Embora os componentes individuais deste procedimento sejam rápidos, no geral, ele pode ser trabalhoso. Geralmente, são necessárias cerca de 350 horas-pessoa para processar aproximadamente 3.500 moscas, desde o ovo até o adulto. Com prática, os indivíduos podem melhorar significativamente os tempos de manipulação das moscas, e este procedimento pode ser usado para medir outras características morfológicas, o que permite a estimativa de relações adicionais de escala morfológica.

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Aqui detalhamos protocolos projetados especificamente para monitorar defeitos morfogênicos que ocorrem durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans. Em última análise, esses protocolos são projetados para identificar genes que regulam essas fases e caracterizar suas necessidades diferenciais ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

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Este artigo descreve um ensaio comportamental que utiliza a unidade de acasalamento dos machos em Drosophila melanogaste r para estudar motivação. Usando este método, os pesquisadores podem utilizar técnicas neurogenéticos mosca avançada para descobrir os mecanismos genéticos, moleculares e celulares que fundamentam essa motivação.

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Aqui, nós descrevemos um método para reduzir o tamanho de embriões do zebrafish sem interromper processos desenvolventes normais. Esta técnica permite o estudo da escala do teste padrão e do robustez desenvolvente de encontro à mudança do tamanho.

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Os produtos químicos do disruptor da glândula endócrina (EDCs) representam um problema sério para organismos e para ambientes naturais. A Drosophila melanogaster representa um modelo ideal para estudar os efeitos da EdC in vivo. Aqui, nós apresentamos métodos para investigar o rompimento da glândula endócrina em Drosophila, abordando efeitos de EDC na fecundidade, na fertilidade, no sincronismo desenvolvente, e no tempo da mosca.

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Aqui, um protocolo para a implementação de microscopia de expansão em embriões iniciais de Drosophila para obtenção de imagens de super-resolução usando um microscópio confocal convencional de varredura a laser é apresentado.

Usando microscopia de expansão para ampliar fisicamente embriões de Drosophila de montagem inteira para imagens de super-resolução

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e de baixo custo para imagens de alta resolução de olhos adultos de Drosophila para quantificar defeitos de padronização e crescimento. Descrevemos nosso protocolo para preparação de amostras por montagem em ponto, aquisição de imagem de alta resolução e análise de imagem.

Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

Descrevemos um método de constrição física para produzir mini embriões a partir de embriões de célula única de Xenopus laevis .

Manipulação Física para Gerar Embriões Mini de Xenopus

Abordagens experimentais de Engenharia de Tecidos

Aprenda a manipular a disponibilidade de alimentos em Drosophila para criar variação de tamanho corporal e estimar relações de escala morfológica entre tamanho do corpo e asa. Este método auxilia pesquisadores em biologia evolutiva.

A manipulação experimental de tamanho do corpo para Estimar Relacionamentos Scaling morfológicas em Drosophila

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