A manipulação experimental de tamanho do corpo para Estimar Relacionamentos Scaling morfológicas em Drosophila
1 de outubro de 2011
Relações de escala morfológica captar e descrever a forma do organismo. Nós apresentamos um método para medir as relações de escala morfológica em toda a gama natural de tamanhos de corpo dos insetos totalmente metamórfica. Usando uma simples manipulação da dieta que aumentar a distribuição de tamanhos de traço, permitindo a descrição exata de como a forma e tamanho co-variar.
O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar uma manipulação cronometrada do desenvolvimento na disponibilidade de alimento para criar uma ampla variedade de tamanhos corporais, que então pode ser usada para estimar a relação de escala entre características morfológicas. Primeiro, ovos são coletados da mesma população de moscas durante três dias, criando três coortes etárias. Quando a coorte mais velha de larvas começa a empalidecer, larvas de todas as coortes são removidas do alimento.
O resultado dessa modificação dietética é uma ampliação da variação no tamanho das pupas. Em seguida, são obtidas imagens das asas de pupas, ninfas e adultos de todos os indivíduos, permitindo a estimativa da relação de escala morfológica entre o tamanho do corpo e o tamanho das asas. Por fim, obtêm-se resultados que demonstram como o tamanho das asas escala com toda a faixa possível de tamanho corporal, ajustando uma regressão linear do tipo dois aos dados.
Neste estudo, utilizamos uma manipulação temporal do desenvolvimento no acesso à nutrição para aumentar experimentalmente a variação no tamanho corporal entre moscas adultas. Isso nos permite estimar as relações de escala morfológica em toda a amplitude de tamanhos corporais. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a expressão e a evolução da escala morfológica, como a identificação da base imediata da variação nos parâmetros das relações de escala entre grupos biológicos.
Transfira uma população de moscas para uma câmara de acasalamento e, em seguida, colete ovos a cada 24 horas durante três dias. Isso criará, ao final, três coortes etárias com a ajuda de um microscópio estereoscópico. Transfira lotes de 50 ovos de cada coorte para frascos contendo 10 mililitros de alimento padrão para moscas.
Incube os frascos à temperatura desejada para o desenvolvimento das larvas. Quando o coorte mais velho atingir o estágio de erradia, é hora de aplicar a manipulação da dieta removendo as larvas do alimento. Neste ponto, as larvas do coorte mais velho já estão bem acima do peso viável mínimo para occlusão e estarão próximas do tamanho corporal máximo natural.
Larvas do grupo intermediário ultrapassaram o peso viável mínimo, mas produzirão adultos menores do que larvas do grupo mais velho. Larvas do grupo mais jovem estão muito próximas do peso viável mínimo e, portanto, produzirão adultos muito pequenos. Para remover as larvas do alimento.
Adicione aproximadamente cinco mililitros de solução de sacarose a 40% aos frascos e, em seguida, agite por 15 a 20 minutos em uma mesa agitadora em velocidade média. Após a agitação, remova as larvas flutuantes da solução de sacarose com um pincel fino e coloque-as, por coorte, em frascos contendo um tampão de algodão úmido para manter a umidade. Incube na temperatura desejada até que ocorra a pupação.
Posicione as pupas sobre uma lâmina de microscópio com a face ventral voltada para cima. Uma vez que as pupas estejam posicionadas, capture imagens utilizando uma câmera digital acoplada ao microscópio. Certifique-se de configurar as configurações para que cada pupa apareça como uma silhueta escura sobre um fundo branco.
Após a aquisição de imagens, transfira cada pupa para um tubo epit individual de dois mililitros contendo um mililitro de ração para moscas. Estime o tamanho da pupila como o número de pixels da silhueta da pupila. Outras métricas de tamanho, como comprimento ou largura, também podem ser utilizadas com o auxílio de um microscópio estereoscópico.
Anestesie levemente a mosca usando dióxido de carbono e posicione-a com um segurador de asas, um dispositivo de sucção que puxa a asa entre dois pedaços de vidro e a mantém perpendicular ao corpo da mosca. Para a obtenção de imagens, embora um segurador de asas seja usado para imagens das asas de moscas vivas neste estudo, asas e outros caracteres podem ser dissecados e analisados com ferramentas comuns. Capture a imagem da asa utilizando a câmera do microscópio conectada ao computador e anote o sexo da mosca. Após a imagem da asa ser capturada e salva, estime o tamanho da asa utilizando, alternativamente, o polígono convexo mínimo que circunscreve marcos fixos marginais como medidas lineares ou a contagem de pixels da silhueta da asa. Aqui, pupas imaginalizadas mostraram os extremos da distribuição de tamanho devido à manipulação da dieta.
Após a pupa ter atingido o peso mínimo viável para inclusão. Também são mostradas as silhuetas correspondentes para a medição do tamanho da pupila. As imagens correspondentes das asas desses mesmos indivíduos nas extremidades da distribuição de tamanho são apresentadas aqui ao lado da silhueta.
Utilizado para estimar a extração do tamanho da asa da relação de escala. Parâmetros que descrevem como o tamanho da asa escala com o tamanho do corpo permitem a comparação de como a forma geral co-varia com o tamanho entre grupos. Aqui, os dados são apresentados para indivíduos de cada sexo que foram totalmente alimentados ou privados de alimento por um ou dois dias durante a fase larval.
Embora os componentes individuais deste procedimento sejam rápidos, no geral, ele pode ser trabalhoso. Geralmente, são necessárias cerca de 350 horas-pessoa para processar aproximadamente 3.500 moscas, desde o ovo até o adulto. Com prática, os indivíduos podem melhorar significativamente os tempos de manipulação das moscas, e este procedimento pode ser usado para medir outras características morfológicas, o que permite a estimativa de relações adicionais de escala morfológica.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para medir relações de escala morfológica em insetos completamente metamórficos, manipulando a dieta para aumentar a variação do tamanho corporal. Ao avaliar como o tamanho das asas escala com o tamanho do corpo, a pesquisa fornece insights sobre a expressão e evolução de características morfológicas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Entomologia
Contexto
- As relações de escala morfológica são fundamentais para compreender a forma dos organismos.
- A manipulação da dieta pode aumentar a variação de tamanho em populações de insetos.
- A estimativa das relações de escala auxilia na compreensão da biologia evolutiva.
- Estudos anteriores não exploraram completamente o impacto da dieta na variação de tamanho em insetos.
Objetivo do Estudo
- Estimar a relação de escala entre o tamanho corporal e o tamanho das asas em moscas.
- Explorar como o acesso à nutrição afeta características morfológicas.
- Fornecer um método para estudar relações de escala em diferentes grupos biológicos.
Métodos Utilizados
- Coletar ovos de uma população de moscas para criar coortes etárias.
- Manipular a dieta removendo larvas do alimento para induzir variação de tamanho.
- Capturar imagens de pupas e asas de adultos para estimativa de tamanho.
- Utilizar regressão linear tipo dois para analisar a relação de escalonamento.
Resultados Principais
- A manipulação da dieta aumentou com sucesso a variação de tamanhos corporais em moscas.
- Verificou-se que o tamanho da asa escala com o tamanho do corpo ao longo da população estudada.
- Os resultados oferecem insights sobre a base imediata das relações de escala.
- O método pode ser aplicado a outras características morfológicas para pesquisas futuras.
Conclusões
- Este estudo demonstra uma abordagem inovadora para o estudo da escala morfológica em insetos.
- O entendimento das relações de escala pode contribuir para a biologia evolutiva e a ecologia.
- Os resultados destacam a importância da dieta na formação de características morfológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de relações de escala morfológica robustas permite a caracterização fenotípica precisa em organismos modelo, apoiando a validação de alvos por meio da análise quantitativa de características. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao vincular perturbações genéticas ou ambientais a saídas morfológicas mensuráveis. O método fornece um arcabouço escalável para reduzir riscos em hipóteses iniciais de descoberta na pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao quantificar como características morfológicas co-variam com o tamanho corporal sob perturbação experimental.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho padronizado para gerar dados fenotípicos em diferentes condições genéticas ou ambientais.
- Valor Estratégico: Apoia a avaliação da confiança no alvo por meio da estimativa reprodutível de parâmetros de escalonamento entre grupos biológicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Produz sistemas biológicos validados com distribuições de tamanho definidas para triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Valor Operacional: Garante prontidão para ensaios por meio de fenotipagem morfológica reprodutível e saídas quantitativas baseadas em imagens.
- Valor Estratégico: Facilita a reutilização da plataforma ao estabelecer protocolos escalonáveis para medição de características em modelos de insetos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Permite a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao capturar como a forma co-varia com o tamanho em coortes geneticamente modificados.
- Valor Operacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores translacionais por meio da análise correlativa da escala morfológica e dos resultados funcionais.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco ao estabelecer relações de escala de referência para estudos comparativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho iniciais de descoberta ao gerar conjuntos de dados fenotípicos escalonáveis que orientam a identificação de compostos promissores e a avaliação pré-clínica por meio da análise quantitativa de características.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a medição de respostas morfológicas a manipulações nutricionais ou genéticas.
- Triagem: Fornece grupos prontos para ensaios com variação aumentada no tamanho corporal, possibilitando a detecção confiável de efeitos de compostos.
- Análises: Fornece saídas de regressão linear tipo dois que quantificam relações de escalonamento de características para comparação entre grupos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao estabelecer parâmetros basais de escalonamento para validação de modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável de fenotipagem morfológica em diferentes sistemas modelo baseados em insetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas relações entre traços e tamanho.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio da variação de tamanho controlada pela dieta e análise de imagens cega.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir decisões precoces de prosseguir/não prosseguir com base em limiares de escalonamento fenotípico.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco por meio da redução quantificável de riscos morfológicos entre classes de alvos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em criação de insetos, estadiamento do desenvolvimento e técnicas de imagem morfológica.
- Depende de infraestrutura de microscopia capaz de realizar imagens de silhueta de alto contraste e morfometria baseada em pixels.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de coleta de coortes, manipulação do momento da dieta e medição de características.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a espécies de insetos não pertencentes ao gênero Drosophila, com diferentes cronologias de desenvolvimento.
- Limitado pela intensidade de mão de obra em coortes de grande escala, embora atenuado por fluxos de trabalho com manuseio simplificado e processamento em lote.
