Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um substrato padronizado bidimensionalmente para o controle da absorção de proteínas e crescimento celular. Isso é conseguido usando fotolitografia para fabricar um mestre padronizado, que é usado para produzir o carimbo A-P-D-M-S para impressão de micro contato. Como segunda etapa, o substrato de ouro padronizado é preparado, o que envolve a impressão de micro contato para produzir um padrão com regiões que absorvem e resistem à proteína.

Em seguida, proteínas e células são adicionadas ao substrato para visualizar o padrão e estudar. Obtém-se resultados de crescimento e comportamento celular que mostram bom confinamento proteico e celular nesses substratos padrão com base em fluorescência e microscopia de contraste facial. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos existentes, como a impressão MicroCon de proteínas, é que a monocamada terminada em glicol resiste à absorção não específica de proteínas e células no fundo do padrão.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a técnica de estampagem adequada deve ser otimizada para cada padrão impresso. Para iniciar a preparação do centro mestre padronizado, o wafer de silício no codificador de rotação e, durante a etapa inicial do programa de centrifugação de dois ciclos, enxágue o wafer com acetona. Durante a segunda etapa do programa de centrifugação, a acetona evaporará deixando um wafer limpo e seco no início da centrifugação, aplicará fotorresistente ao wafer e, em seguida, centrifugará a camada usando as condições descritas anteriormente.

Asse suavemente o wafer revestido fotorresistente a 110 graus Celsius por dois minutos usando uma placa quente de alta uniformidade. Próximo padrão de foto. O wafer revestido fotorresistente usando um sistema de alinhador de máscara e uma máscara apropriada.

Primeiro, coloque o substrato no caminhão de vácuo do alinhador de máscara. Em seguida, insira a máscara na bandeja de suporte e ligue o aspirador para manter a máscara no lugar para confirmar um bom contato entre a máscara e o substrato. Levante o substrato até encontrar a máscara.

Use a ótica do alinhador para confirmar que um bom contato foi feito. Por fim, ligue a lâmpada para expor o substrato à luz UV através da máscara litográfica. Desenvolva o wafer padronizado no revelador por um minuto e 45 segundos com agitação suave.

Enxágue abundantemente com água deionizada de grau semicondutor e seque com um fluxo de gás nitrogênio para verificar o desenvolvimento do padrão usando um microscópio com filtro UV. Comece este procedimento preparando um endurecedor de resina de 10 a um por peso. Mistura de charuto 180 2 completamente.

Cubra o wafer com padrão fotográfico com a mistura em uma placa de Petri descartável em um Degas dessecador a vácuo, o mestre coberto com PDMS até que nenhuma bolha seja visível. Depois de se certificar de que o mestre está no fundo do prato, deixe o carimbo curar em um forno a 65 graus Celsius por 1,5 horas. Quando o carimbo PDMS estiver curado, corte o carimbo do mestre e corte-o no tamanho apropriado.

Guarde o carimbo em um recipiente coberto com o lado voltado para cima para protegê-lo de poeira e detritos. Para preparar os substratos para deposição de metal, primeiro trate lamínulas de vidro redondas com plasma de oxigênio por 10 minutos. Em seguida, enxágue as lamínulas duas vezes com água deionizada, secando com o jato de gás nitrogênio entre os enxágues após o enxágue com água, enxágue duas vezes com etanol, secando novamente com o jato de gás nitrogênio entre os enxágues.

Usando um sistema de deposição de feixe de elétrons de bolso múltiplo, deposite 50 angstroms de titânio seguido de 150 angstroms de ouro. Não coloque o evaporador entre a deposição da camada de titânio e a camada de ouro. Enxágue o carimbo PDMS com etanol e seque bem.

Com gás nitrogênio, aplique a solução de estampagem no carimbo gota a gota até que esteja totalmente revestido. Seque bem o carimbo com gás nitrogênio. A impressão por microcontato do arquivo HEXA Decane depende das características do carimbo PDMS e é um dos aspectos mais difíceis deste procedimento.

A estampagem bem-sucedida requer o desenvolvimento de uma boa técnica que aplique pressão uniforme. Durante a estampagem. Para impressão convencional por microcontato ao ar, pressione suavemente o carimbo no substrato dourado e deixe a monocamada formar por 15 segundos.

Alternativamente, para padrões compostos por características muito pequenas e altas proporções, coloque o substrato de ouro em uma placa de Petri contendo 18,2 mega om de água deionizada, garantindo que o substrato esteja submerso. Em seguida, pressione suavemente o carimbo no substrato dourado e deixe a camada mono se formar por 15 segundos. Em seguida, enxágue o substrato estampado duas vezes com etanol secando com gás nitrogênio.

Após cada enxágue, coloque o substrato em uma placa de Petri e cubra o substrato com solução de enchimento. Sele o prato com um parâmetro para evitar a evaporação. Deixe a monocamada de fundo se formar no escuro por 12 a 14 horas.

Por fim, remova a lamínula padronizada da solução de enchimento traseiro e enxágue duas vezes com etanol secando com gás nitrogênio após cada enxágue. Para aplicar proteína à lamínula padronizada, coloque a lamínula em uma pequena placa de Petri ou em uma câmara de cultura de células Cubra com 500 microlitros a um mililitro de solução salina tamponada com fosfato delcos. O DPBS deve cobrir completamente o substrato durante a incubação da proteína.

Para garantir uma cobertura uniforme de proteína, adicione uma solução concentrada de proteína ao DPBS e misture a solução pipetando várias vezes. Incube a mistura de proteínas com o substrato a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, enxágue bem o substrato com DPBS para remover a proteína não ligada, tomando cuidado para não secar o substrato ou trazê-lo pela interface ar-água.

Após três enxágues, aspire o DPBS. Em seguida, adicione aproximadamente 500 microlitros de meio de crescimento celular completo para manter um substrato úmido. Substitua o meio de crescimento usado para enxaguar o substrato.

Com meios frescos, o substrato agora está pronto para ser revestido com células. Normalmente, 30 a 200 células por milímetro quadrado são revestidas no substrato. Esta imagem mostra o carimbo A-P-D-M-S visualizado sob um microscópio, colocando o lado do selo voltado para baixo em uma lamínula de vidro, a barra de escala é de 100 micrômetros.

A estampagem adequada resulta em um padrão de proteína nítido e claro que pode ser visualizado pela aplicação de uma proteína marcada com fluorescência, como a fibronectina marcada com LOR 6 47. O confinamento das células chk um ao padrão de proteína é mostrado aqui. As barras de escala são de 100 micrômetros nessas imagens.

Alternativamente, a imuno-histoquímica pode ser usada para visualizar o padrão proteico após a fixação da US. Aqui, o anticorpo antilaminado conjugado LOR três 50 é usado para visualizar o laminado padronizado semeado com neurônios do hipocampo de camundongo E 18 mostrados em quatro dias in vitro Neurônios do hipocampo de camundongo E 18 corados com rastreador MIT vermelho cinco 80 mostram que o crescimento celular está bem confinado ao padrão de proteína. Embora essa técnica seja facilmente dominada, vários problemas comuns podem surgir, conforme ilustrado por essas preparações de substrato padrão visualizadas pela absorção de fibronectina conjugada LOR 6 47.

A aplicação de proteína sem mistura suficiente da solução proteica concentrada na DPBS pode levar a padrões proteicos desiguais. A estampagem inadequada pode levar à transferência parcial do padrão ou ao colapso do carimbo. Além disso, expor o substrato padrão contendo proteína absorvida ao ar pode romper a monocamada, causando diminuição da resistência.

Em segundo plano, a padronização submersa pode produzir padrões com pequenos recursos que são difíceis de imprimir por impressão convencional de micro contato e ar. Essas duas imagens mostram diferentes regiões do mesmo padrão impresso com o mesmo carimbo PDMS em linhas de suporte de ar ou água deionizada são mostradas na imagem à esquerda para demonstrar que apenas as pequenas características do padrão não foram impressas com sucesso. As barras de escala são de 20 micrômetros Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 18 a 24 horas se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar um substrato padrão. Produza o selo A-P-D-M-S. Utilize a impressão de micro contato para preparar um substrato de ouro padrão e visualize esse padrão usando proteínas e células.