Inibição da atividade neuronal e sua detecção usando eletrofisiologia em um rato

Comece com um rato anestesiado preso em uma estrutura estereotáxica com o crânio exposto.

Usando os marcos anatômicos, o bregma e o lambda, localize o colículo superior, uma estrutura cerebral profunda responsável pelo processamento de informações visuais.

Perfure para criar um retalho ósseo, remova-o e aplique um tampão para manter o cérebro exposto hidratado.

Posicione um conjunto injectrode consistindo de uma micropipeta com um eletrodo conectado a uma microsseringa.

A micropipeta contém uma solução de neurotransmissor inibitório para suprimir a excitabilidade neuronal enquanto o eletrodo registra simultaneamente a atividade neuronal.

Abaixe a injeção no colículo superior e cubra a superfície exposta com ágar fundido para evitar a desidratação.

A luz presente pisca no olho para estimular os neurônios e evocar potenciais de ação sincronizados.

Injete o neurotransmissor, que se liga aos seus receptores e desencadeia o influxo de íons cloreto.

Esse influxo hiperpolariza o potencial de membrana, suprimindo assim os potenciais de ação.

À medida que a concentração do neurotransmissor diminui com o tempo, a atividade neuronal se recupera.

Para preparar as pipetas de injeção de registro, primeiro puxe um capilar de 7 centímetros com um diâmetro externo de 1 milímetro. Para um modelo vertical policial 720 ou unidade similar, ajuste o aquecedor para 18 e o solenóide para um. Em seguida, usando luvas, quebre manualmente a ponta para fazer uma abertura e verifique ao microscópio se o diâmetro interno está entre 30 e 40 micrômetros. Meça isso com a régua do visor. Ele produzirá uma impedância relativamente baixa de 0,3 a 0,6 megaohms.

Em seguida, a partir da extremidade não cônica, insira um fio de prata na pipeta com cerca de 7 centímetros de comprimento e deixe 1 a 2 centímetros pendurados na pipeta. Dobre esse excesso de fio ortogonalmente ao capilar. Em seguida, pegue uma agulha hipodérmica de calibre 30 e aplique adesivo plástico flexível no eixo. Em seguida, insira lentamente a agulha na pipeta o máximo possível.

Adicione mais adesivo para criar uma vedação na junção entre a pipeta e a agulha. Com a ponta da pipeta para cima, deixe o conjunto secar por cerca de 12 horas. Depois de anestesiar e colocar o rato em uma estrutura estereotáxica, aplique pomada oftálmica, raspe a cabeça.

Depois de aplicar um anestésico local e confirmar um plano cirúrgico de anestesia, prossiga com a incisão do couro cabeludo ao longo do canteiro central usando uma lâmina de bisturi número 10. Isso irá expor as suturas coronal e sagital. Em seguida, com o uso de uma espátula cirúrgica, identifique as referências anatômicas lambda e bregma.

Ajuste a posição da cabeça para que esses pontos de referência fiquem nivelados no mesmo plano horizontal. Em seguida, zere um ponteiro rígido fino como um tubo de vidro no bregma. Em seguida, ajuste a posição do tubo para um local de interesse usando as coordenadas do bregma.

Use um Sharpie para desenhar um quadrado ao redor da área-alvo para a craniotomia. Agora, com a broca cirúrgica esterilizada, remova lentamente o osso ao longo das marcas. Comece usando o mínimo de pressão possível e mantenha a broca em movimento para evitar danos ao tecido induzidos pela cabeça devido ao atrito.

Quando o osso ficar fino, remova cuidadosamente a seção quadrada com uma pinça. A dura-máter não precisa ser removida, pois a haste de injeção irá penetrá-la. Daqui para frente, mantenha o córtex exposto irrigado com líquido cefalorraquidiano. Prepare o injectrode enchendo primeiro uma seringa de 5 a 10 microlitros com óleo mineral. Em seguida, prepare o medicamento de interesse com um corante em soro fisiológico. Aqui, 0,5% de Chicago Sky Blue é misturado com 300 GABA micromolar.

Agora, encha a pipeta de injeção carregando primeiro uma seringa de 1 mililitro com a solução preparada e, em seguida, usando a seringa para carregar a pipeta. Ao remover a seringa, mantenha uma leve pressão no êmbolo, para que o vácuo não remova a solução da injeção. Verifique se há fluido escapando em possíveis pontos de vazamento. Limpe o excesso de líquido e verifique novamente se há vazamentos.

Agora conecte a micro seringa com óleo mineral ao injetor. Em seguida, limpe o excesso de solução com gaze. Verifique a ponta de injeção. Deve ser possível fluir pequenas gotas de solução através dele. Caso contrário, ele está bloqueado ou vazando. Agora, monte com segurança o injectrode em um sistema de micro bomba. Em seguida, mova a posição do injetado para as coordenadas alvo e abaixe o eletrodo até o colículo superior, que pode ser identificado por meio do registro de potenciais evocados visuais.

Enquanto o eletrodo estiver abaixado, aplique uma pequena pressão positiva aplicando uma baixa taxa de injeção para evitar entupimento. Interrompa a injeção quando a estrutura for atingida. Depois de inserir o injetor, cubra o córtex exposto com ágar quente para evitar a dessecação.

Após a colocação final do eletrodo, aguarde 30 minutos para permitir a estabilização do tecido ao redor do eletrodo. Em seguida, injete 400 a 800 nanolitros de solução a uma taxa de 40 nanolitros por minuto, até a inativação da atividade neuronal no colículo superior. O eletrodo deve mostrar uma redução nos picos durante a injeção da solução inibitória.