Injeção viral estereotáxica para edição de genes neuronais direcionados no cérebro de camundongos

Prenda um mouse anestesiado em uma estrutura estereotáxica.

Desinfete o couro cabeludo raspado e, em seguida, faça uma incisão na linha média para expor o crânio.

Seque o crânio e aplique peróxido de hidrogênio para melhorar a visibilidade do bregma.

Localize bregma e lambda e, em seguida, identifique os locais de destino.

Perfure cuidadosamente o crânio nos locais de destino.

Conecte a seringa cheia de vírus ao instrumento estereotáxico.

O vírus codifica Cas9 e um RNA de guia único para edição do genoma em neurônios do giro denteado, juntamente com um repórter fluorescente para rotular neurônios infectados.

Abaixe a seringa para alcançar o giro dentado e, em seguida, injete o vírus lentamente para garantir uma distribuição uniforme.

Levante gradualmente a seringa e repita a injeção em coordenadas adicionais.

Faça uma breve pausa para evitar o refluxo e, em seguida, retire a agulha lentamente.

Repita o procedimento no hemisfério oposto.

Finalmente, suturar a incisão.

O modelo agora está pronto para estudos adicionais.

Raspe a cabeça de um camundongo anestesiado para se preparar para o local da injeção. Direcione o isoflurano a 4% para o cone do nariz. Em seguida, coloque o mouse no instrumento estereotáxico. Insira a barra de mordida em sua boca até que seus dentes caiam na ranhura antes de prender as barras auriculares.

Certifique-se de que o corpo do animal esteja na almofada de aquecimento e o nariz esteja situado no cone do nariz. Em seguida, confirme a anestesia dando uma pitada no pé. Em seguida, aplique lágrimas artificiais para lubrificar os olhos. Em seguida, esfregue a cabeça raspada com iodo povidona e lidocaína.

Agora, faça uma pequena incisão ao longo da linha média do couro cabeludo. Seque o crânio com um cotonete e aplique peróxido de hidrogênio para ajudar a visualizar o bregma. Usando um escopo de dissecação, localize o bregma no crânio e coloque a broca acima dele. Defina as coordenadas estereotáxicas digitais dos planos x, y e z como 0.

Para garantir que a cabeça esteja nivelada no eixo y caudal rostral, coloque a broca em lambda e nivele a cabeça de modo que a coordenada z seja aproximadamente igual a 0 em bregma e lambda. Para garantir que a cabeça esteja nivelada ao longo do eixo x, coloque a broca no ponto médio entre bregma e lambda e meça as coordenadas z a 1 milímetro do ponto médio em ambos os lados para garantir que sejam iguais.

Em seguida, abaixe o isoflurano para 2% antes de colocar a broca sobre as coordenadas desejadas e perfure o crânio com cuidado. Depois de fazer todos os orifícios, fixe a seringa cheia de vírus no instrumento estereotáxico. Centralize a seringa sobre o orifício e defina a coordenada z no crânio para 0. Abaixe lentamente a seringa até a profundidade z mais profunda e comece a injeção a uma taxa de 0.25 microlitros por minuto usando um injetor estereotáxico.

Após a injecção estar concluída na profundidade z mais profunda, aguarde um minuto antes de a elevar para a próxima coordenada e inicie novamente a injecção. Continue esse padrão até que todas as coordenadas de injeção z sejam injetadas. Após a última injeção, aguarde dois minutos antes de retirar a seringa. Em seguida, remova o mouse do instrumento estereotáxico e suture o couro cabeludo. Aplique lidocaína e creme antibacteriano no local da cirurgia e administre analgésicos antes de transferir o animal para uma câmara de recuperação aquecida.