Visualização de redes neurais e vasculares em um embrião de galinha

Comece com um ovo de galinha fertilizado com janela contendo um embrião em estágio inicial com seu tubo neural excisado no nível de somitos de um a sete.

Pegue um tubo neural de doador marcado com GFP de um embrião de galinha transgênico compatível com o estágio e implante-o no receptor, garantindo a orientação anatômica adequada.

Remova o excesso de líquido ao redor do enxerto para aumentar a adesão entre os tecidos do doador e do hospedeiro.

Sele a janela com fita adesiva transparente para evitar desidratação e contaminação.

Incube o ovo até que o embrião se desenvolva até o estágio desejado.

Remova a fita.

Identifique uma veia vitelina na gema que transporta sangue em direção ao embrião e remova a membrana vitelina sobrejacente.

Usando uma agulha de vidro, injete firmemente um corante fluorescente lipofílico na veia.

Visualize o embrião sob um microscópio de estereofluorescência.

O corante injetado se liga às células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos, destacando a rede vascular, enquanto o tubo neural marcado com GFP permite o rastreamento da rede neural.

Quando estiver pronto para iniciar o procedimento de enxerto, transfira cuidadosamente o tubo neural dissecado do vidro do relógio para o embrião hospedeiro. Posicione o tubo neural na orientação correta. E empurre suavemente o explante adjacente na região excisada. Se necessário, use o microbisturi para aparar o explante no tamanho exato da região excisada.

Uma vez na posição correta, remova o PBS e outros fluidos para ajudar os tecidos do doador e do hospedeiro a aderir e estabelecer o enxerto. A integração bem-sucedida do tubo neural positivo para GFP enxertado no hospedeiro de galinha do tipo selvagem pode ser avaliada sob um microscópio de fluorescência. Sele toda a janela com fita transparente de 24 milímetros de largura para evitar desidratação e contaminação.

Rotule o embrião quimérico. E devolva o ovo à incubadora para desenvolvimento posterior.

No momento experimental desejado, recupere o ovo da incubadora. E remova a fita transparente para ter acesso ao embrião. Uma vez visível, localize uma veia acessível na gema, certificando-se de que o fluxo sanguíneo seja direcionado para o embrião.

Escolha um ponto de ramificação em uma das veias vitelinas para o local da injeção. Use uma pinça para remover a membrana vitelina acima do ponto de injeção escolhido, rasgando em direções opostas. Em seguida, ajuste o diâmetro de uma agulha de vidro puxada para o tamanho da veia.

Carregue a agulha com 5 a 10 microlitros de solução DiI. Insira rapidamente a agulha na veia. E sopre firmemente com o tubo bucal para permitir que o DiI se junte ao fluxo sanguíneo lentamente sem formar um coágulo. O sucesso da injeção de DiI pode ser avaliado visualizando brevemente o embrião sob um microscópio de fluorescência.