Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:21 min. • June 17th, 2025
Pegue uma placa de imagem com fundo de vidro contendo neurônios corticais embrionários de camundongos.
Coloque o prato dentro da câmara ambiental de um microscópio de contraste de interferência diferencial, ou DIC, para manter a viabilidade celular durante a imagem.
A microscopia DIC divide a luz polarizada em dois feixes que atravessam a amostra.
Variações no índice de refração em todo o corpo de prova introduzem mudanças de fase entre esses feixes.
Quando os feixes se recombinam, sua interferência gera uma imagem de alto contraste, tornando visíveis estruturas celulares mais finas.
Identifique neurônios com axônios não ramificados e use imagens de lapso de tempo para visualizar a ramificação axonal.
Trate com netrina-1, uma pista de orientação extracelular que se liga aos receptores axonais e desencadeia exocitose localizada.
As vesículas exocíticas fornecem componentes de membrana aos locais enquanto o citoesqueleto é reorganizado para suportar a expansão da membrana.
Ao microscópio, essas alterações aparecem como pequenas saliências, marcando o início da ramificação axonal.
Com o tempo, essas saliências se desenvolvem em ramos axonais maduros, ilustrando o processo dinâmico do desenvolvimento neuronal.
Em dois dias in vitro, coloque o prato de imagem com fundo de vidro contendo neurônios não transfectados em uma câmara ambiental úmida pré-aquecida. Utilize um microscópio equipado com um apocromático plano de 60x, 1,4 NA, lente objetiva DIC e um condensador de alta abertura numérica para obter a melhor qualidade e resolução de imagem. Em seguida, com a iluminação de luz transmitida, ajuste o plano focal para encontrar neurônios através das oculares.
Para imagens DIC de ramificação de axônio, a configuração adequada da iluminação mais fria será essencial para a otimização da imagem e é fundamental para produzir resultados analisáveis. Em seguida, com os neurônios de interesse dentro do campo de visão, use a função de aquisição de várias áreas no software de imagem para encontrar e salvar as localizações XYZ de pelo menos seis células. Agora, adicione a uma concentração final de 250 nanogramas por mililitro de netrin-1 ou outro fator de interesse para estimular as células e pressione Iniciar aquisição de várias áreas.
Sequencialmente, adquira imagens em cada posição a cada 20 segundos por 24 horas, pausando a aquisição e refocalizando conforme necessário. No software de imagem, revise as imagens escolhendo Aplicativo, Revisar dados multidimensionais e abra o arquivo desejado. Identifique ramos de axônios estáveis que se formam durante a sessão de imagem. Use a ferramenta de região de rastreamento para medir uma ramificação de axônio estável da base do axônio até a ponta.