Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:25 min. • June 17th, 2025
Comece com uma câmara experimental revestida de elastômero de silicone contendo um músculo de camundongo seguro posicionado sob um microscópio confocal.
O músculo é imerso em uma solução fisiológica contendo inibidores que bloqueiam as contrações musculares.
O coto nervoso marcado com um corante fluorescente de cálcio é posicionado dentro do eletrodo de sucção, que é conectado a um estimulador elétrico.
Na junção neuromuscular, o nervo periférico está conectado ao músculo.
Aplique um estímulo elétrico ao nervo usando o eletrodo. Isso desencadeia um rápido influxo de íons de cálcio que se ligam ao corante de cálcio intracelular.
Ilumine a junção neuromuscular para excitar o corante de cálcio, fazendo com que ele fique fluorescente.
Em seguida, capture imagens de alta resolução para registrar transientes rápidos de cálcio nas terminações nervosas periféricas.
Selecione a região de interesse e meça a intensidade da fluorescência.
Um rápido aumento na intensidade da fluorescência indica influxo de cálcio nas terminações nervosas periféricas, enquanto uma diminuição reflete a depuração do cálcio.
Encha o sistema de perfusão com a solução de Ringer contendo 10 micromolares D-tubocurarina e ligue a bomba de sucção de perfusão para iniciar a perfusão. No software Laser Scanning Confocal Microscope, ou LSCM, escolha eletrofisiologia e modo de aquisição para definir os parâmetros de imagem. Nas configurações do menu Trabalho, selecione as configurações do acionador para acionar o estimulador com o pulso de sincronização do microscópio e defina o campo Trigger Out on Frame para o canal OUT 1.
Gire o modo de varredura para xyt a uma frequência de varredura de 1.400 Hertz. O fator de zoom deve ser 6.1 com o orifício totalmente aberto. Certifique-se de que o modo x bidirecional de transpassagem sequencial esteja ativado. Em seguida, defina o tempo mínimo para formar um quadro em 52 milissegundos e colete quadros em um vídeo bruto em 20 quadros. Defina o comprimento de onda de excitação do laser de argônio em 488 nanômetros, com 8% da potência de saída.
Quando os parâmetros estiverem definidos, pressione o botão Live Mode para obter uma visualização ao vivo dos terminais nervosos carregados com o corante. No modo ao vivo, procure a região de interesse, ou ROI, para obter o melhor foco e, em seguida, mude o atraso no estimulador em 2 milissegundos a menos em relação ao valor anterior. E execute o software de aquisição de dados para adquirir 26 sequências, deslocando cada sequência em dois milissegundos da anterior.