Imagem de transientes rápidos de cálcio em terminações nervosas de camundongos usando microscopia confocal

Comece com uma câmara experimental revestida de elastômero de silicone contendo um músculo de camundongo seguro posicionado sob um microscópio confocal.

O músculo é imerso em uma solução fisiológica contendo inibidores que bloqueiam as contrações musculares.

O coto nervoso marcado com um corante fluorescente de cálcio é posicionado dentro do eletrodo de sucção, que é conectado a um estimulador elétrico.

Na junção neuromuscular, o nervo periférico está conectado ao músculo.

Aplique um estímulo elétrico ao nervo usando o eletrodo. Isso desencadeia um rápido influxo de íons de cálcio que se ligam ao corante de cálcio intracelular.

Ilumine a junção neuromuscular para excitar o corante de cálcio, fazendo com que ele fique fluorescente.

Em seguida, capture imagens de alta resolução para registrar transientes rápidos de cálcio nas terminações nervosas periféricas.

Selecione a região de interesse e meça a intensidade da fluorescência.

Um rápido aumento na intensidade da fluorescência indica influxo de cálcio nas terminações nervosas periféricas, enquanto uma diminuição reflete a depuração do cálcio.

Encha o sistema de perfusão com a solução de Ringer contendo 10 micromolares D-tubocurarina e ligue a bomba de sucção de perfusão para iniciar a perfusão. No software Laser Scanning Confocal Microscope, ou LSCM, escolha eletrofisiologia e modo de aquisição para definir os parâmetros de imagem. Nas configurações do menu Trabalho, selecione as configurações do acionador para acionar o estimulador com o pulso de sincronização do microscópio e defina o campo Trigger Out on Frame para o canal OUT 1.

Gire o modo de varredura para xyt a uma frequência de varredura de 1.400 Hertz. O fator de zoom deve ser 6.1 com o orifício totalmente aberto. Certifique-se de que o modo x bidirecional de transpassagem sequencial esteja ativado. Em seguida, defina o tempo mínimo para formar um quadro em 52 milissegundos e colete quadros em um vídeo bruto em 20 quadros. Defina o comprimento de onda de excitação do laser de argônio em 488 nanômetros, com 8% da potência de saída.

Quando os parâmetros estiverem definidos, pressione o botão Live Mode para obter uma visualização ao vivo dos terminais nervosos carregados com o corante. No modo ao vivo, procure a região de interesse, ou ROI, para obter o melhor foco e, em seguida, mude o atraso no estimulador em 2 milissegundos a menos em relação ao valor anterior. E execute o software de aquisição de dados para adquirir 26 sequências, deslocando cada sequência em dois milissegundos da anterior.