Geração Teratoma na Cápsula do Testículo
7 de novembro de 2011
As células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) têm o potencial para tratar uma miríade de diferentes doenças. A utilidade destas células reside no facto de que eles podem diferenciar-se em qualquer tipo de célula no corpo. Descrevemos aqui o ensaio teratoma, que é usado para demonstrar a pluripotência das hPSCs.
O objetivo geral deste procedimento é avaliar a pluripotência por meio da geração de teratomas na cápsula testicular de camundongos imunocomprometidos utilizando células-tronco pluripotentes humanas ou CTPHs. Comece colhendo uma cultura das CTPHs putativas a serem testadas quanto à pluripotência. Em seguida, realize uma cirurgia para expor os testículos do camundongo e injete as células na cápsula testicular.
Coloque os testículos de volta em sua localização original e feche cirurgicamente o camundongo; após seis a doze semanas, examine o tumor resultante por histologia para verificar a presença de células de cada uma das camadas germinativas. Em última análise, os resultados podem demonstrar que uma linhagem de CPH é verdadeiramente pluripotente ao mostrar que ela é capaz de se diferenciar em células derivadas das três camadas germinativas em um camundongo imunocomprometido. Embora novos métodos para demonstrar a pluripotência de células-tronco humanas tenham sido recentemente descritos, o ensaio de teratoma permanece como o padrão-ouro na área para demonstrar o procedimento será tron, um técnico sênior no meu laboratório de cultura.
Cultive as células-tronco pluripotentes humanas até a confluência e, em seguida, dissocie os HPSEs com Accutase, conte as células e re-suspenda 1 milhão de HPCs por injeção. Primeiro, depile o abdômen de camundongos machos imunocomprometidos com seis semanas de idade anestesiados usando uma tesoura elétrica. Limpe a parede anterior do abdômen do camundongo com solução de iodopovidona, iniciando do centro do abdômen e movendo-se em sentido horário para fora.
Em seguida, lave a área raspada com etanol 70%. Repita o processo três vezes, trocando os cotonetes a cada vez. Para realizar o procedimento cirúrgico, transfira o animal para uma placa aquecida dentro de uma câmara estéril com tesoura cirúrgica estéril.
Realize uma incisão longitudinal de um centímetro através da pele e do peritônio logo abaixo do nível da articulação do quadril, segurando o peritônio com pinças. Alcance com outro par de pinças estéreis em direção ao quadril direito e puxe o tecido adiposo branco junto com os testículos anexos. Agora, encha uma seringa tuberculínica de um CC com as hpsc a serem injetadas. Injete lentamente de 20 a 30 microlitros de H PSCs no centro da cápsula testicular, longe de quaisquer vasos sanguíneos principais.
Remova lentamente a agulha para evitar o refluxo das células usando pinças. Retorne os testículos e o tecido adiposo para sua posição original no abdômen. Feche o peritônio com dois ou três pontos reabsorvíveis e feche a pele com clipes automáticos.
Após a cirurgia, administre analgesia duas vezes ao dia conforme necessário. Monitore o animal quanto ao crescimento tumoral palpável ao longo de seis a doze semanas. Quando o tumor atingir aproximadamente cinco milímetros, remova-o do camundongo sacrificado para documentação.
Fotografe o tumor e meça o tamanho e o peso. Em seguida, corte o tumor em pequenos pedaços e fixe em solução de paraformaldeído 4% para histopatologia. Normalmente, um teratoma é observado após seis a doze semanas.
Neste exemplo, 1 milhão de células-tronco pluripotentes humanas WA oh nove foram injetadas na cápsula testicular de um camundongo imunocomprometido. O exame detalhado do teratoma revela heterogeneidade e muitos cistos aderidos. Como esperado.
As análises histopatológicas indicam a presença de células derivadas dos três folhetos germinativos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de incluir uma linhagem celular controle positivo que se sabe ser bastante potente, para garantir que o ensaio foi realizado corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como determinar se uma linhagem de células-tronco humanas é ou não pluripotente.
Visão Geral
Este artigo discute o ensaio de teratoma, um método utilizado para avaliar a pluripotência de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). O ensaio envolve a injeção de hPSCs na cápsula do testículo de camundongos imunocomprometidos e a análise dos teratomas resultantes quanto à diferenciação em diversos tipos celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Medicina Regenerativa
- Histopatologia
Antecedentes
- As células-tronco pluripotentes humanas podem diferenciar-se em qualquer tipo celular.
- A formação de teratoma é um indicador fundamental da pluripotência.
- O ensaio é considerado o padrão-ouro para demonstrar a pluripotência.
- Existem novos métodos, mas o ensaio de teratoma continua amplamente utilizado.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a pluripotência de hPSCs por meio da formação de teratoma.
- Fornecer uma metodologia detalhada para a realização do ensaio de teratoma.
- Destacar a importância do uso de um controle positivo no ensaio.
Métodos Utilizados
- Coleta de hPSCs e preparação para injeção.
- Exposição cirúrgica do testículo de camundongo e injeção de hPSCs.
- Monitoramento do crescimento tumoral ao longo de seis a doze semanas.
- Análise histológica do teratoma para diferenciação das camadas germinativas.
Resultados Principais
- Teratomas formados após seis a doze semanas pós-injeção.
- A análise histopatológica confirmou a presença de células dos três folhetos germinativos.
- Demonstrou a eficácia do ensaio de teratoma na avaliação da pluripotência.
- Incluiu um controle positivo para validar os resultados do ensaio.
Conclusões
- O ensaio de teratoma é um método confiável para confirmar a pluripotência de hPSCs.
- Técnicas cirúrgicas adequadas e monitoramento são cruciais para resultados bem-sucedidos.
- Estudos futuros podem explorar métodos alternativos juntamente com ensaios tradicionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio de teratoma fornece uma leitura funcional da pluripotência ao demonstrar a capacidade de diferenciação em todas as três camadas germinativas in vivo. Este ensaio apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento inicial de terapias baseadas em células-tronco. Ele permite confiança preditiva na identidade celular antes de avançar para modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Confirma a pluripotência ao verificar a diferenciação em linhagens de ectoderma, mesoderma e endoderma.
- Valor Operacional: Utiliza um modelo in vivo padronizado para reduzir alegações falsas positivas de pluripotência.
- Valor Estratégico: Permite decisões de prosseguir ou não prosseguir quanto à adequação da linhagem de células-tronco para o desenvolvimento terapêutico.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas histopatológicas para representação das camadas germinativas.
- Valor Operacional: Estabelece um protocolo reprodutível utilizando injeção na cápsula testicular em camundongos imunocomprometidos.
- Valor Estratégico: Apoia a padronização de ensaios entre laboratórios para testes de pluripotência consistentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Valida o potencial de desenvolvimento de hPSCs antes da diferenciação em progenitores específicos de linhagem.
- Valor Operacional: Exige monitoramento ao longo de 6–12 semanas para formação de tumores e análise histopatológica.
- Valor Estratégico: Orienta o avanço ajustado ao risco de linhagens de células-tronco para estudos pré-clínicos de eficácia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de teratoma atua como uma etapa de controle no processo de descoberta de células-tronco, posicionado após a manutenção da pluripotência e antes da diferenciação direcionada ou dos testes pré-clínicos de eficácia.
- Biologia da Descoberta: Testa a hipótese central de pluripotência por meio da avaliação da capacidade de diferenciação trilinagear.
- Triagem: Gera taxas padronizadas de formação de teratomas e pontuação histológica para avaliação comparativa de linhagens.
- Análises: Fornece resultados específicos por folheto germinativo por meio de histopatologia para quantificar o potencial de diferenciação.
- Pesquisa Translacional: Conecta a confirmação de pluripotência a fluxos de trabalho de diferenciação subseqüentes para a produção de células relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Atua como um ponto de verificação de pluripotência reutilizável para múltiplas linhagens de hPSC na triagem de pipelines terapêuticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na identidade das células-tronco ao confirmar a pluripotência funcional.
- Valor Operacional: Fornece resultados padronizados e reprodutíveis por meio de procedimentos cirúrgicos e histológicos definidos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao eliminar linhagens não pluripotentes no início do desenvolvimento.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização baseada em risco das linhagens de células-tronco para investimento em diferenciação e modelagem de doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cirurgia de roedores e técnica estéril para injeção na cápsula testicular.
- Depende do acesso a linhagens de camundongos imunocomprometidos e instalações para monitoramento pós-operatório.
- Necessita de infraestrutura de histopatologia para identificação das camadas germinativas em seções de teratomas.
- Envolve supervisão ética e aprovação do IACUC para o uso de animais em ensaios de tumorigenicidade.
- Limitado pelo período de 6–12 semanas, o que pode retardar campanhas iterativas de triagem.
