Entrega intranasal de siRNA ao cérebro de camundongo usando um dispositivo de posicionamento

Comece com camundongos anestesiados colocados em um dispositivo de posicionamento com as costas paralelas ao apoio para as costas da cadeira e perpendiculares ao assento.

Os ratos são posicionados em uma postura de cabeça para baixo e para frente e presos com cintos de cadeira.

Usando uma micropipeta carregada com um complexo peptídeo-siRNA direcionado a neurônios, coloque uma gota perto de uma narina, permitindo que o camundongo inale a solução naturalmente.

Pressione suavemente a cabeça do camundongo para baixo durante a inalação para evitar que a solução escorra para os pulmões.

Faça uma breve pausa e repita a administração na outra narina.

Repita o procedimento para os ratos restantes.

O complexo penetra na mucosa nasal, de onde entra nos nervos olfatório e trigêmeo e viaja por eles para chegar ao cérebro.

Dentro do cérebro, o complexo se liga a receptores neuronais, sofre endocitose e facilita a entrega intracelular de siRNA.

O siRNA torna-se parte do complexo RISC, que, ao se ligar ao mRNA alvo, induz o silenciamento gênico.

Para iniciar este procedimento, avalie o nível de anestesia do reflexo bípede dos camundongos para manter o plano cirúrgico. Em seguida, coloque o dispositivo de posicionamento a uma distância e altura apropriadas para permitir o acesso conveniente a todos os reagentes necessários.

Em seguida, aplique pomada nos olhos do animal. Prenda um mouse com cintos de cadeira, certificando-se de que os membros anteriores do mouse forneçam suporte natural enquanto ele está em uma posição relaxada sem nenhum desconforto. Repita os procedimentos para os ratos restantes. Coloque suavemente cada mouse na cadeira designada, colocando as costas paralelas ao apoio traseiro da cadeira e a 90 graus em relação ao assento da cadeira.

Deixe o animal deitar naturalmente na posição de cabeça para baixo e para a frente, sem empurrar ou pressionar. Assim que todos os camundongos estiverem amarrados, inicie imediatamente a inoculação intranasal. Para realizar a administração intranasal, carregue a micropipeta com 2 microlitros de solução complexa de RVG9R-siRNA. Segure a pipeta com a mão dominante e apoie-a com a outra mão para evitar movimentos descontrolados durante a administração de siRNA.

Coloque cerca de uma gota de 2 microlitros bem perto de uma narina para que o camundongo possa inalá-la diretamente. Se uma pequena gota não for facilmente formada, substitua a ponta da pipeta por uma nova e repita a operação. Empurre suavemente a cabeça do mouse para baixo com o dedo indicador por 5 segundos enquanto inspira e mantenha a posição.

Para evitar a drenagem da droga para os pulmões, é importante empurrar levemente a cabeça do camundongo para baixo com o dedo indicador por 5 segundos enquanto o camundongo está inalando.

Inicie um cronômetro para cronometrar três a quatro minutos depois disso para cronometrar a inoculação na segunda nara do primeiro camundongo. Este intervalo de tempo é necessário para que o camundongo complete a inalação da primeira dose e restaure a respiração normal. No intervalo de três a quatro minutos entre a inoculação de narinas alternadas no primeiro camundongo, inoculação intranasal completa de uma narina em cada um dos três camundongos restantes colocados no dispositivo.

Quando o cronômetro soar, inocule a segunda narina no primeiro camundongo e repita o procedimento para os outros camundongos como acima. Repita o procedimento até que os 20 a 30 microlitros sejam entregues para todos os quatro camundongos. Levará cerca de 30 a 45 minutos para concluir todo o procedimento de inoculação. Devolva os animais às gaiolas designadas. Não deixe os camundongos sozinhos até que eles tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.