Transfecção mediada por eletroporação de gânglios da raiz dorsal de camundongos para promover a regeneração sensorial do axônio

Pegue um camundongo anestesiado com os gânglios da raiz dorsal L4 e L5 expostos contendo corpos celulares de neurônios sensoriais.

Carregue uma pipeta de microinjeção com construções de RNA marcadas com fluoróforo que regulam a regeneração do axônio e um corante traçador.

Injete a mistura nos DRGs.

Usando eletrodos de eletroporação, aplique pulsos elétricos aos DRGs.

Isso rompe as membranas dos corpos celulares dos neurônios sensoriais, criando poros que permitem que as construções entrem no citoplasma, facilitando a transfecção.

Suture a incisão e permita que o camundongo se recupere.

Após alguns dias, re-anestesiar e prender o mouse.

Faça uma incisão lateral à linha média à esquerda. Disseque os músculos para expor o nervo ciático.

Esmague o nervo para ferir os axônios dos neurônios sensoriais. Marque o local com um nó de sutura.

Suture a incisão e permita que o camundongo se recupere.

As construções transfectadas têm como alvo mRNAs em corpos celulares de neurônios sensoriais DRG, modulando transitoriamente a produção de proteínas para aumentar a regeneração sensorial do axônio pós-lesão.

Para injeção de DRG, carregue os plasmídeos de DNA ou oligos de RNA na pipeta capilar de vidro. Em seguida, insira cuidadosamente a ponta da pipeta capilar de vidro no DRG. E injete gradualmente 1 microlitro de solução de plasmídeos de DNA ou oligos de RNA usando o sistema de distribuição de microinjeção intracelular.

Para eletroporação, aperte o DRG alvo com os eletrodos suavemente e aplique pulsos elétricos de 5 quadrados com o sistema de eletroporação. Posteriormente, feche o músculo e, em seguida, as camadas de pele com suturas de náilon. Dois ou três dias após a eletroporação do DRG, anestesiar o camundongo por via intraperitoneal, prender seus membros no quadro de cortiça e fazer uma incisão de 1 centímetro 0,5 centímetros para o lado esquerdo ao longo da linha média.

Em seguida, corte os músculos, como o músculo glúteo máximo e o músculo piriforme longitudinalmente. Em seguida, exponha o segmento do nervo ciático entre o forame isquiático maior e a incisura ciática. Esmague o nervo com uma pinça de microcirurgia por 12 segundos e marque o local do esmagamento com uma sutura epineural de náilon. Em seguida, feche as camadas muscular e cutânea com sutura de náilon.