Name: Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprenda a usar fotólise de compostos caged para estudar transdução olfativa em neurônios sensoriais de camundongo. Este método combina patch-clamp com luz ultravioleta para ativar canais sensíveis a nucleotídeos cíclicos e analisar respostas neurais.

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<ol><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).</li>
<li>Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-gated+ion+channels+in+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction.</a> FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).</li>
<li>Bozza, T. C., Kauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+properties+of+convergent+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).</li>
<li>Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+and+Ultrafast+Phototriggers+for+cAMP+and+cGMP+by+Using+Long-Wavelength+UV%2FVis-Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).</li>
<li>Rapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+lamp-based+irradiation+of+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flash lamp-based irradiation of caged compounds.</a> Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).</li>
<li>Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurney%2C+AM+%22Microelectrodes%3A+Theory+and+Applications%22">Microelectrodes: Theory and Applications</a>. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).</li>
<li>Lagostena, L., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+and+photolysis+of+caged+compounds+in+olfactory+sensory+neurons+isolated+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse.</a> Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).</li>
<li>Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+adaptation+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+does+not+require+the+activity+of+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase.</a> J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).</li>
<li>Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+development+of+cyclic+nucleotide-gated+and+Ca2%2B+-activated+Cl-+currents+in+isolated+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).</li>
<li>Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+jumps+reveal+dynamic+ion+selectivity+of+calcium-activated+chloride+currents+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+and+TMEM16B-transfected+HEK+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells.</a> J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).</li>
<li>Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+Functional+Analysis+of+Ion+Channels+Heterologously+Expressed+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).</li>
<li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Responses+of+Mouse+Olfactory+Sensory+Neurons+Using+the+Air-phase+Electroolfactogram+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).</li>
<li>Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+using+a+light+emitting+diode%3A+an+efficient%2C+compact%2C+and+affordable+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution.</a> Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Flash fotólise de compostos enjaulado combinado com patch-clamp gravações é uma técnica útil para obter saltos rápidos e local da concentração de moléculas ativas fisiologicamente dentro e fora das células. Vários tipos de compounds1 enjaulado foram sintetizados, e esta técnica pode ser aplicada a vários tipos de células, incluindo células cultivadas expressar canais iônicos que podem ser ativadas ou moduladas por fotólise de alguns dos compostos disponíveis enjaulado 11. Fotólise...

<table border="1"><tbody><tr><th> Equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Adaptador módulo da lâmpada de flash para microscópio </td><td> Rapp optoeletrônicos </td><td> FlashCube 70 </td><td></td></tr><tr><td> Air tabela </td><td> TMC </td><td> MICRO-g 63-534 </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1322A </td><td></td></tr><tr><td> Aquisição de Dados Software </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp 8 </td><td></td></tr><tr><td> Software Análise de dados </td><td> WaveMetrics </td><td> Igor </td><td></td></tr><tr><td> Espelho para módulo adaptador </td><td> Rapp optoeletrônicos </td><td> M70/100 </td><td></td></tr><tr><td> Suporte do eletrodo </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Gaiola de Faraday </td><td> Feitos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubo de filtro </td><td> Olimpo </td><td> U-UTH </td><td> Filtro de excitação removido </td></tr><tr><td> Lâmpada de flash </td><td> Rapp optoeletrônicos </td><td> JML-C2 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps Dumont # 55 </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 14099 </td><td></td></tr><tr><td> Capilares de vidro </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> PG10165-4 </td><td></td></tr><tr><td> Prato fundo de vidro </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> FD35-100 </td><td></td></tr><tr><td> Iluminador </td><td> Olimpo </td><td> Destaque 3100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Luigs &amp; Neumann </td><td> SM eu </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta Puller </td><td> Narishige </td><td> PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor </td><td> HesaVision </td><td> MTB-01 </td><td></td></tr><tr><td> Os filtros de densidade neutra </td><td> Omega Optical </td><td> varia </td><td></td></tr><tr><td> Objetivo 100X </td><td> Zeiss </td><td> Fluar 440285 </td><td> Ou Zeiss ou Olympus </td></tr><tr><td> Objetivo 100X </td><td> Olimpo </td><td> UPLFLN 100XOI2 </td><td> Ou Zeiss ou Olympus </td></tr><tr><td> Ópticos UV shortpass filtro </td><td> Rapp optoeletrônicos </td><td> SP400 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador de patch-clamp </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B </td><td></td></tr><tr><td> Foto de díodo </td><td> Rapp optoeletrônicos </td><td> PDA </td><td></td></tr><tr><td> Guia de luz de quartzo </td><td> Rapp optoeletrônicos </td><td> varia </td><td> Usamos 600 mM de diâmetro </td></tr><tr><td> Fio de prata </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> AGT1025 </td><td></td></tr><tr><td> Prata chão pellet </td><td> Warner instrumentos </td><td> 64-1309 </td><td></td></tr><tr><td> Xenon arco da lâmpada </td><td> Rapp optoeletrônicos </td><td> XBL-JML </td><td></td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> BCMCM gaiolas cAMP </td><td> Biolog </td><td> B016 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A8806 </td></tr><tr><td> CaCl2 solução padrão 0,1 M </td><td> Fluka </td><td> 21059 </td></tr><tr><td> Ca Caged: DMNP-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> D6814 </td></tr><tr><td> Cisteína </td><td> Sigma </td><td> C9768 </td></tr><tr><td> Concanavalina A V tipo (ConA) </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C4036 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma </td><td> P1767 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Sigma </td><td> L0649 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Fluka </td><td> 63020 </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Sigma </td><td> P3125 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P1274 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma </td><td> P2256 </td></tr></tbody></table>

flash fotólise de compostos caged no cilia de olfactory neurônios sensoriais

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos 1. Caged compostos são moléculas feitas fisiologicamente inativo por uma gaiola química que pode ser quebrado por um flash de luz ultravioleta. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de compostos enjaulado para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos. O processo de transdução olfativos (Figura 1) ocorre nos cílios dos neurônios sensoriais olfativos, onde odorant ligação aos receptores leva ao aumento de cAMP que abre nucleotídeo cíclico-gated (CNG) canais 2. Ca entrada através de canais CNG ativa os canais de Ca-activated Cl. Mostramos como dissociar os neurônios do epitélio olfativo do mouse 3 e como ativar canais CNG ou canais de Ca-Cl ativado por fotólise de cAMP enjaulado enjaulados Ca 4 ou 5 &lt;/ Sup&gt;. Nós usamos uma lâmpada de flash 6,7 aplicar flashes ultravioleta à região ciliar para libertar da gaiola ou cAMP Ca enquanto patch-clamp gravações são tomadas para medir a corrente em toda a configuração de tensão de células-clamp 11/08.

Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de cAMP gaiola ou enjaulado Ca para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

A fotólise de compostos enjaulados permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de diversos compostos fisiologicamente ativos1. ...

O nosso sentido do olfato permite-nos detetar e reconhecer substâncias químicas voláteis no ambiente externo. Os odores ligam-se a recetores na região dos neurónios sensoriais olfativos e ativam uma cascata de transdução que leva à abertura de canais ativados por nucleótidos cíclicos, seguida pela ativação de canais de cloreto ativados por cálcio. O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como ativar diretamente estes canais através da exposição rápida à luz de compostos engaiolados; os compostos engaiolados são moléculas tornadas fisiologicamente inativas por uma estrutura química protetora.Um flash de luz ultravioleta quebra uma cápsula e libera o composto fisiologicamente ativo contido na cápsula. Cycl, mp ou cálcio encapsulado são incluídos na solução intracelular, preenchendo uma pipeta de patch, e difundem-se até o corpo de neurônios sensoriais olfativos. Um flash ultravioleta é aplicado à região Cary para liberar cicl, mp ou cálcio enquanto são realizados registros em clamp de patch para medir a corrente na configuração de clamp de voltagem em célula inteira.Olá. Hoje vamos mostrar a vocês um procedimento para gravações de patch clamp combinado com liberação por fotoe

flash-photolysis-caged-compounds-cilia-olfactory-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Microscopia multifotônica permite o controle de fótons de baixa energia com penetração profunda e fototoxicidade óptica reduzida. Descrevemos a utilização desta tecnologia para a rotulagem de células vivas em embriões de peixe-zebra. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para foto-indução de várias moléculas sensíveis à luz.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Um método é descrito para a preparação de células vivas único fotorreceptoras de diferentes espécies de vertebrados para imagens de fluorescência. O método pode ser usado para a imagem da fluorescência de fluoróforos endógenos, como o NADH ou vitamina A, ou que de adicionado exogenamente corantes fluorescentes sensíveis ao...

Preparação das Condições de Vida isolaram células Fotorreceptoras Vertebrados para imagens de fluorescência

Nós descrevemos uma técnica estabelecida para medir e analisar odor evocadas respostas de cálcio no lobo antenal de...

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Este artigo apresenta os protocolos de sinais ópticos intrínsecos e flavoproteínas imagem sinais autofluorescência para mapear odor evocadas atividades na superfície do bulbo olfatório em ratos.

Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

Adulto-nascido neurônios expressando ChR2 pode ser manipulado em preparações fatia eletrofisiológicos, a fim de examinar sua contribuição para a função olfativa de circuitos neurais.

Acessível usando Arrays LED para Foto Estimulação de Neurônios

Este vídeo demonstra um método para imagens de cálcio in vivo usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em moscas. Ele descreve as etapas para preparar as moscas para microscopia, conduzir o condicionamento olfativo e visualizar o influxo de cálcio induzido por odor.

in vivo Imagens de cálcio usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em Drosophila melanogaster

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e...

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Nós desenvolvemos uma nova técnica de microscopia electrónica, de "flash-e-congelamento", que permite a visualização da dinâmica da membrana com ms resolução temporal. Esta técnica combina a estimulação optogenetic de neurónios com congelamento de alta pressão. Aqui, demonstramos os procedimentos e descrever os protocolos em detalhe.

Flash-e-Freeze: uma nova técnica para capturar Membrane Dynamics com Electron Microscopy

Vesícula sináptica (SV) ciclismo é o mecanismo de núcleo de comunicação intercelular em sinapses neuronais. Liberação e absorção de corante de FM são o principal meio de análise quantitativa do SV endo e exocitose. Aqui, nós comparamos todos os métodos de estimulação para conduzir FM1-43 ciclismo da sinapse de modelo de junção neuromuscular (JNM) de Drosophila .

Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Aprenda a usar fotólise de compostos caged para estudar transdução olfativa em neurônios sensoriais de camundongo. Este método combina patch-clamp com luz ultravioleta para ativar canais sensíveis a nucleotídeos cíclicos e analisar respostas neurais.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

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