Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais
29 de outubro de 2011
Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de cAMP gaiola ou enjaulado Ca para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos.
O nosso sentido do olfato permite-nos detetar e reconhecer substâncias químicas voláteis no ambiente externo. Os odores ligam-se a recetores na região dos neurónios sensoriais olfativos e ativam uma cascata de transdução que leva à abertura de canais ativados por nucleótidos cíclicos, seguida pela ativação de canais de cloreto ativados por cálcio. O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como ativar diretamente estes canais através da exposição rápida à luz de compostos engaiolados; os compostos engaiolados são moléculas tornadas fisiologicamente inativas por uma estrutura química protetora.
Um flash de luz ultravioleta quebra uma cápsula e libera o composto fisiologicamente ativo contido na cápsula. Cycl, mp ou cálcio encapsulado são incluídos na solução intracelular, preenchendo uma pipeta de patch, e difundem-se até o corpo de neurônios sensoriais olfativos. Um flash ultravioleta é aplicado à região Cary para liberar cicl, mp ou cálcio enquanto são realizados registros em clamp de patch para medir a corrente na configuração de clamp de voltagem em célula inteira.
Olá. Hoje vamos mostrar a vocês um procedimento para gravações de patch clamp combinado com liberação por fotoestímulo de compostos contidos em gaiolas. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar canais ativados por CMP e canais de colina ativados por cálcio em neurônios sensoriais olfativos. Então, vamos começar.
O sistema de gravação por patch clamp utilizado aqui inclui um microscópio invertido, um sistema de perfusão, um micromanipulador, um eletrodo de gravação e um eletrodo de referência conectado ao estágio principal do amplificador de patch clamp, tudo montado sobre uma mesa antivibração dentro de uma gaiola de Faraday. O amplificador de patch clamp está conectado a um digitalizador no computador com software para aquisição de dados. Para gerar um flash de luz ultravioleta de alta intensidade, utilizamos uma lâmpada de flash Excelon.
O flash de luz pode ser acionado manualmente ou pelo computador, utilizando o mesmo software que controla a aquisição eletrofisiológica. Os melhores comprimentos de onda para experimentos fotográficos são selecionados inserindo um filtro UV em um compartimento de saída ou na lâmpada de flash. A intensidade do flash de luz pode ser modificada alterando a voltagem ou a capacitância da lâmpada de flash.
Um controle mais preciso da intensidade da luz é obtido colocando filtros de densidade neutra em um segundo compartimento de saída da lâmpada de xenônio. O pulso de luz é direcionado ao neurônio cultivado em placas com fundo de vidro por meio de uma guia de luz de fibra óptica de quartzo. A guia de luz está conectada ao acoplamento de fluorescência em epifluorescência do microscópio invertido.
Usando um adaptador, um cubo de filtro modificado sem filtro de excitação direciona um feixe UV para o neurônio por meio de um espelho dicróico. A luz é focalizada através de uma objetiva de imersão a óleo de 100 x. A área coberta pelo tecido é visualizada inserindo-se a guia de luz em um iluminador.
A imagem é visualizada em um monitor por meio de uma câmera CCD conectada ao microscópio. O controle da área é desenhado no monitor para localizar a área de luz UV para os experimentos antes da dissecação, prepare três placas com fundo de vidro revestidas com con A e poli. Para se preparar para a dissecação, encha dois pratos de Petri revestidos com açúcar de 50 milímetros com solução de Ringer.
Coloque-os no gelo. Resfrie também. Misture firmemente 0,5 mililitro da solução de parada e a seringa contendo cerca de 10 mililitros da solução de Ringer.
Inicie com o camundongo sacrificado. Remova a pele que reveste o crânio, corte ao longo das linhas da mandíbula e coloque a cabeça em uma placa de Petri revestida com prata. Posicione a placa sob um microscópio estereoscópico e, com um bisturi, faça um corte sagital.
Disseque a cabeça ao longo da linha média. Vire metade da cabeça com o lado medial voltado para cima. Remova cuidadosamente o septo para expor os terminais.
Aqui mostramos uma imagem ampliada enquanto removemos o septo utilizando pinças número três no bisturi. Remova cuidadosamente as terminações revestidas pelo seu epélio adiposo. Transfira para outro ígara revestido com prata utilizando pinças superfinas número 55 e o bisturi.
Sequencie pedaços do epitélio refatorado do tecido subjacente. Transfira os pedaços de epitélio olfativo para um tubo contendo um mililitro de solução de Ringer sem íons divalentes. Em seguida, adicione a papaína.
O uso de tesouras microcirúrgicas significa que o epitélio incuba à temperatura ambiente por três minutos; agite suavemente novamente com as tesouras microcirúrgicas. Aguarde cinco minutos adicionais, utilizando uma pipeta de vidro com ponta ampla e polida ao chama, transfira para um tubo contendo a solução de parada e centrifugue por cinco minutos; descarte o sobrenadante. Adicione cerca de um mililitro de solução de Ringer filtrada e agite suavemente com uma pipeta de vidro com ponta polida ao chama e diâmetro interno de aproximadamente um mililitro.
Coloque a solução contendo as células no centro de três placas de vidro. Deixe as células sedimentarem por cerca de uma hora a quatro graus Celsius em placas com fundo de vidro. Em seguida, adicione a solução de Ringer.
Trabalhe com luz fraca para evitar a degradação dos compostos foto-ligantes pela luz ambiente. Aplique uma gota de óleo de imersão na objetiva de 100 x. Coloque um recipiente com fundo de vidro contendo os neurônios sensoriais oratórios dissociados sobre a platina do microscópio invertido perfu.
Com solução de Ringer. Proteja a seringa contendo a solução intracelular com compostos de gaiola da luz usando papel alumínio e mantenha-a refrigerada. Procure um neurônio sensorial olfatório isolado com cílios intactos.
Mova a platina do microscópio para posicionar a região Cary dentro da área desenhada no monitor. Para localizar a área do flash de UV, preencha um pipeta de grampo com solução intracelular contendo o composto gaiola. Insira a pipeta no suporte da platina do amplificador de grampo Apache.
Utilizando técnicas padrão de patch clamp. Aproxime o soma do neurônio com uma pipeta de patch e obtenha um selo giga. Em seguida, atinja o modo de célula inteira no computador.
Inicie um protocolo de estimulação e registre a resposta. Um protocolo de estimulação típico fixa a voltagem em um valor constante e dispara a liberação de um flash de UV para a lise do composto engaiolado. Agora mostraremos alguns registros representativos; aqui é mostrada a resposta de um neurônio sensorial isolado de gordura de camundongo à lise do composto engaiolado de cicl mp.
A seta no topo indica o momento da liberação de um estímulo UV. A corrente ativada por Cycl MP foi registrada em menos 60 milivolts em uma solução ringer extracelular com baixo teor de cálcio. A fase ascendente da corrente foi rápida e foi ajustada por uma função exponencial simples.
Aqui observamos uma gravação do mesmo neurônio banhado em solução de Ringer normal, que contém um milimolar de cálcio. A fase ascendente da corrente em menos 60 milivolts tornou-se muito menor e multifásica. Isso se deve à ação do cálcio que entra pelos canais ativados por P no processo de reciclagem de C, ativando uma corrente secundária de cloreto.
Neste exemplo, fixamos a tensão em mais 60 milivolts. Esta é outra maneira de reduzir a entrada de cálcio. A fase ascendente da resposta devido à liberação fotoativa do cyclone PN a mais 60 milivolts foi bem descrita por uma única exponencial, indicando a presença de apenas um componente de corrente.
Um exemplo das respostas obtidas pela liberação fotoinduzida de cálcio no interior do cílio é mostrado; esta corrente é conduzida por íons cloreto. A voltagem era de menos 50 milivolts. Respostas de amplitudes crescentes foram induzidas pela liberação fotoinduzida de cálcio encapsulado com pulsos de luz ultravioleta de intensidades crescentes.
Acabamos de mostrar como registrar de neurônios sensoriais de corpúsculos de Pacini dissociados ao realizar este procedimento. É importante lembrar-se de ser muito paciente. Obrigado por assistir e boa sorte com o experimento.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo demonstra o uso da fotólise de compostos encobertos para investigar a transdução olfativa em neurônios sensoriais olfativos de camundongo. Ao utilizar gravações por patch-clamp, os pesquisadores podem observar os efeitos do cAMP encoberto e do Ca encoberto na atividade neuronal.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Transdução olfativa
Antecedentes
- O olfato é essencial para detectar substâncias químicas voláteis.
- Os neurônios sensoriais olfativos desempenham um papel fundamental na transdução dos sinais olfativos.
- Compostos encageados são utilizados para controlar o momento da liberação de moléculas ativas.
- A fotólise permite a ativação rápida de vias de sinalização.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a ativação de canais ativados por nucleotídeos cíclicos.
- Medir os efeitos do cAMP preso na gaiola e do Ca preso na gaiola sobre neurônios sensoriais olfativos.
- Ampliar a compreensão dos mecanismos de transdução de sinal olfativo.
Métodos Utilizados
- Registros de patch-clamp de neurônios sensoriais olfativos dissociados de camundongo.
- Uso de cAMP preso em gaiola e Ca preso em gaiola na solução intracelular.
- Aplicação de luz ultravioleta para fotolizar compostos presos em gaiola.
- Configuração de clamp de voltagem em célula inteira para medição de corrente.
Resultados Principais
- Observou-se a ativação bem-sucedida de canais ativados por nucleotídeos cíclicos.
- Foram obtidos aumentos localizados nas concentrações de cAMP e Ca.
- Registros de patch-clamp forneceram informações sobre as respostas neuronais.
- A metodologia demonstrou controle eficaz sobre as vias de sinalização.
Conclusões
- A fotólise de compostos aprisionados é uma ferramenta poderosa para o estudo da sinalização neuronal.
- Essa abordagem pode aprimorar nossa compreensão da transdução olfativa.
- Estudos futuros podem se basear nesses métodos para explorar outras vias de sinalização.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A fotólise de compostos aprisionados permite controle temporal e espacial preciso de moléculas sinalizadoras intracelulares, apoiando a redução de riscos mecanicistas na validação precoce de alvos em neurociência. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva ao permitir a investigação direta da função de canais de cloro ativados por cálcio e canais ativados por nucleotídeos cíclicos em neurônios sensoriais olfativos. O método fornece uma plataforma transponível para avaliar a dinâmica de canais iônicos regulados por ligantes em sistemas neuronais relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a ativação direta de canais ativados por nucleotídeos cíclicos para investigar mecanismos de transdução olfativa e validar hipóteses de sinalização dependente de cAMP.
- Valor Operacional: Proporciona aumentos localizados e rápidos na concentração de cAMP ou cálcio para isolar contribuições específicas de vias sem efeitos secundários confundidores.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos em alvos ao confirmar o acoplamento funcional entre ativação do receptor, produção de mensageiro secundário e respostas de canais iônicos downstream.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do ensaio: Combina a liberação fotolítica com eletrofisiologia por patch-clamp para gerar medidas quantitativas e em tempo real de corrente como leituras funcionais.
- Reprodutibilidade: Utiliza parâmetros padronizados da lâmpada de flash e seleção de filtros UV para garantir controle consistente da intensidade luminosa e do comprimento de onda entre experimentos.
- Escalabilidade: Emprega guias de luz óptica de fibra de quartzo e sistemas de microscópio invertido para fornecer estimulação UV precisa a neurônios dissociados em formatos compatíveis com placas de múltiplos poços.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a disfunção de neurônios sensoriais olfativos em que a atividade dos canais regulados por nucleotídeos cíclicos ou canais de cloreto ativados por cálcio está alterada, apoiando estudos mecanicistas de condições relacionadas à anosmia.
- Continuidade Translacional: Conecta o engajamento do alvo molecular (liberação de cAMP/Ca²⁺) com fenótipos eletrofisiológicos, permitindo a correlação entre eventos bioquímicos e a atividade funcional dos neurônios.
- Redução de Riscos Mecanicistas: Isola variáveis como a concentração extracelular de cálcio para distinguir correntes primárias mediadas por canais regulados por nucleotídeos cíclicos das contribuições secundárias dos canais de cloreto ativados por cálcio.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a validação orientada por hipóteses de alvos de canais iônicos antes da identificação de compostos líderes, com resultados que informam a preparação de ensaios para campanhas de triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação mecanicista de vias de transdução olfativa ao permitir o controle temporal preciso da liberação de mensageiros secundários para avaliar a cinética e seletividade do gating de canais.
- Triagem: Gera sinais eletrofisiológicos (amplitude da corrente, tempo de subida, dependência de voltagem) que podem ser utilizados para avaliar os efeitos de compostos sobre a função de canais ativados por nucleotídeos cíclicos ou canais de cloreto ativados por cálcio.
- Análise: Fornece medidas quantitativas de corrente sob o regime de clamp de voltagem em célula inteira, permitindo a comparação de respostas evocadas por fotólise entre diferentes condições e genótipos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a dinâmica de mensageiros secundários com a excitabilidade neuronal em um modelo de neurônio sensorial relevante para doenças, apoiando a validação funcional alinhada a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de fotólise-eletrofisiologia aplicável a outros compostos engaiolados e subtipos neuronais além dos sistemas olfativos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na sinalização olfativa ao permitir a ativação direta, controlada por luz, de canais ativados por nucleotídeos cíclicos e canais de cloreto ativados por cálcio.
- Valor Operacional: Oferece liberação reprodutível e localizada por meio de lâmpada de flash e sistemas de orientação óptica, minimizando a variabilidade na administração do composto e melhorando a consistência dos dados.
- Valor Estratégico: Aumenta a confiança nas decisões de prosseguimento ou interrupção na validação de alvos ao fornecer evidências causais que associam flutuações de mensageiros secundários a resultados eletrofisiológicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na função validada dos canais e na fidelidade da sinalização em preparações neuronais fisiologicamente relevantes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em eletrofisiologia com patch-clamp, técnicas de fotólise e dissociação de neurônios olfativos.
- Depende de lâmpada de flash ultravioleta, guia de luz de fibra de quartzo e microscópio invertido com acoplamento de epifluorescência para entrega precisa de UV.
- Necessita padronização das concentrações intracelulares de compostos encageados e da composição da solução extracelular para controle de efeitos secundários dependentes de cálcio.
- Envolve considerações de adaptação ao ser aplicado a diferentes tipos neuronais ou compartimentos subcelulares, devido a variações na difusão do composto encageado e na penetração da luz UV.
- É limitado pela necessidade de equipamentos especializados (lâmpada de flash, filtros de densidade neutra, filtros UV) e manipulação cuidadosa para prevenir a degradação dos compostos encageados pela luz ambiente.
