Autólogas progenitoras endoteliais Cell Technology Semear e Teste de biocompatibilidade para dispositivos Cardiovascular em Modelo Animal Grande
9 de setembro de 2011
Um método para semeadura de titânio de sangue entrar em contato com biomateriais com células autólogas e biocompatibilidade teste é descrito. Este método utiliza células progenitoras endoteliais e tubos de titânio, semeadas em poucos minutos de implante cirúrgico em suínos as cavas. Esta técnica é adaptável a muitas outras implantáveis dispositivos biomédicos.
O objetivo geral deste experimento é semear implantes vasculares com células progenitoras endoteliais derivadas de sangue autólogo e, em seguida, observar o efeito desse tratamento sobre a trombose em um modelo animal de grande porte. Isso é conseguido mediante a obtenção de uma amostra de sangue periférico de suínos para isolar células progenitoras endoteliais porcinas de crescimento tardio. Em seguida, um dispositivo implantável.
O tubo de titânio no nosso estudo de prova de princípio é revestido com as PC autólogas. O dispositivo é então implantado na veia cava inferior do porco. Os resultados mostram proteção contra trombose com base na perviedade do tubo de titânio revestido com CEP, em contraste com o controle e o tubo metálico nu ocluído.
A cirurgia da Duke está comprometida em promover pesquisas inovadoras e inovadoras. A apresentação a seguir é um exemplo de como trabalhamos entre departamentos e disciplinas para avançar na medicina. O Dr. EK tem liderado um esforço de pesquisa para desenvolver uma tecnologia de acomodação celular que previna a trombose revestindo a superfície de contato sanguíneo de dispositivos vasculares com as próprias células progenitoras do paciente.
Como essas células foram derivadas dos mesmos pacientes que receberão o implante, evitamos a rejeição pelo sistema imunológico. Nossos sucessos e os métodos descritos aqui são resultado de um grande esforço de equipe. A implantação cirúrgica será demonstrada por Sean Gage, da seção de cirurgia vascular, Whitney Lane, estudante de medicina da Duke, e por mim mesmo.
Agora gostaria de apresentar Alexander Janssen, um estudante de doutorado do Departamento de Engenharia Biomédica, que nos guiará pelo processo de semeadura celular em detalhes. Demonstrarei como semear tubos de titânio com células progenitoras endoteliais derivadas de sangue logo antes da implantação em um modelo suíno. Este método serve como prova de conceito, e os mesmos princípios básicos podem ser aplicados a muitos outros dispositivos implantáveis, como stents de nitinol e dispositivos mecânicos de assistência circulatória. As CPEs são isoladas por meio do plaqueamento da fração de células mononucleares do sangue suíno e geralmente aparecem após cerca de sete dias.
Eles podem ser reconhecidos por sua morfologia típica de calçada. Expanda as EPCs até um número total de 9 milhões de células em cultura. Lave as EPCs preparadas duas vezes em meio livre de soro, tomando cuidado para limitar a exposição à luz durante e após a marcação.
Em seguida, cubra as células com um marcador fluorescente, PKH 26, e registre a quantidade de solução aplicada. Incube as células à temperatura ambiente por quatro minutos. Interrompa a reação de marcação adicionando um volume igual de soro suíno à solução do corante um minuto depois.
Dilua as soluções combinadas em proporção um para um com meio de crescimento completo. Em seguida, aspire o líquido e lave as células três vezes com meio de crescimento completo, seguido por duas lavagens com DPBS sem cloreto de cálcio ou magnésio. A seguir, cubra as células com tripsina, anotando o volume utilizado, e incube-as a 37 graus Celsius.
Após três minutos de incubação, utilize microscopia para verificar se as células se destacaram e, caso afirmativo, adicione uma quantidade duas vezes maior de solução de neutralização da tripsina do que a quantidade adicionada anteriormente. Tripsina, combine as soluções celulares em um único tubo e meça a densidade celular com um hemocitômetro. Por fim, centrifugue a suspensão celular e re-suspenda as células em pelo menos 4,5 mililitros de meio livre de soro.
Após preparar o porco para a cirurgia, faça uma incisão na linha média com uma lâmina de bisturi número 15, partindo do segundo par de glândulas de memória. Progrida cranialmente até o penúltimo par, utilizando eletrocautério. Continue a dissecação até alcançar a fáscia abdominal.
Levante o peritônio com pinças mosquito e ingresse cuidadosamente com a tesoura Metzenbaum, exteriorize a bexiga urinária e coloque um ponto em bolsa de seda 3-0 de Vicryl na parede da bexiga. Faça uma incisão puniforme em seu centro e insira um cateter Foley de 16 French na incisão. Em seguida, administre líquidos intravenosos para titular a diurese em pelo menos um mililitro por quilograma por hora durante a cirurgia.
Em seguida, exteriorize o segmento intestinal pequeno aumentado e posicione dois afastadores cirúrgicos Bour para expor a face posterior da cavidade peritoneal e identificar a veia cava inferior (IVC) por meio de dissecação afiada e romba. Libere cuidadosamente a IVC dos tecidos circundantes. Em seguida, desveinhe o vaso desde a artéria renal direita proximal até a bifurcação da IVC distal.
Extremo cuidado durante a dissecação da VCI, pois mesmo um defeito muito pequeno na VCI pode levar a hemorragia rápida e exsanguinação do animal. Todos os ramos laterais do segmento da VCI exigem cuidado especial durante a dissecação e ligadura das duas grandes veias lombares posteriores imediatamente próximas à bifurcação da VCI. Frequentemente, há uma veia lombar grande no lado posterior.
Disseque esta veia livremente e controle-a com alças vasculares. Agora, paralelamente à cirurgia, comece a semear o implante com CEPs antes de iniciar este procedimento. As estruturas de suporte para encaixe tecidual em tubo de titânio devem estar totalmente montadas e prontas para uso em um campo estéril.
Abra o conjunto de tubo de titânio esterilizado por gás em uma seringa de cinco cc. Em seguida, remova o êmbolo da seringa de cinco cc, mas não o descarte. Ajuste uma tampa fixa à seringa. Utilize uma pipeta para encher a seringa com a suspensão de EPC.
Em seguida, recoloque o êmbolo. Remova a tampa e insira a extremidade da seringa com a isca na extremidade aberta da tubulação de silicone do conjunto até que fique bem ajustada. Mas não vá além; remova todas as bolhas avançando lentamente a solução celular até que ela atinja o topo da peça superior.
Em seguida, feche o conjunto com uma tampa atrativa e fixe-a com fita em uma luva estéril. Insira todo este conjunto em um suporte de seringa usinado e coloque-o em uma incubadora a 37 graus Celsius. Utilize um medidor para garantir que as câmaras de alojamento estejam niveladas e permita que o conjunto incube com rotação suave.
Continue a cirurgia logo após a ligadura da veia cava inferior administrando 100 unidades de heparina por quilograma de porco. Em seguida, clamp a veia cava inferior imediatamente num ângulo de 45 graus distalmente na veia cava e na veia lombar, e depois proximalmente. A seguir, use uma lâmina de bisturi número 11 e tesoura de ponta para fazer uma venotomia longitudinal de quatro centímetros entre os clamps proximal e distal.
Aspire qualquer sangue da VCI e lave seu lúmen interno com DPBS estéril. Agora, insira o implante com EPC ou um controle de metal nu na VCI para evitar que as células sequem e para remover o ar. Encha a VCI com DPBS contendo cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.
Em seguida, feche a venotomia com uma sutura contínua de proleno 4-0 e remova um clamp proximal para desaerar a veia cava inferior por meio de uma pequena quantidade de sangramento retrógrado. Após o sangramento, remova o clamp distal para manter o implante no lugar. Aplique uma sutura de contenção no tubo de PVC que atravessa a parede da veia.
Fechamento da fáscia com OPDS em agulha de CT. Fechamento do espaço subcutâneo com dois pontos contínuos de Vicryl. Em seguida, fechar a pele com grampos.
Administre até 20 mililitros de Marcaine 0,25% por via subcutânea ao longo do local da incisão e cubra a ferida com gaze e Tegaderm para alívio da dor. Administre flu Nixon e oximorfona por via subcutânea conforme necessário. Descontinue a anestesia e, quando o porco acordar, devolva-o à sua gaiola ao longo dos próximos sete dias.
Administre atri a cada 24 horas como profilaxia antibiótica e certifique-se de que o adesivo de fentanil aplicado antes da cirurgia permaneça aderido por um total de três dias. Após três dias, os implantes de tubo de titânio posicionados foram removidos e as superfícies internas foram examinadas. Sob comprimento de onda de excitação de 550 nanômetros, uma camada confluente de células marcadas com fluorescência foi encontrada em outro tubo.
As células das seções foram adicionalmente coradas com um marcador de adesão celular plaquetária endotelial para visualizar as bordas celulares. Uma grande variedade de corantes pode ser utilizada neste procedimento. Em contraste, um implante de tubo de titânio sem revestimento se oclui completamente no ambiente protrombótico de baixo cisalhamento da veia cava inferior.
Conforme ilustrado nas imagens A e C, o tubo de titânio com células acomodadas é mostrado na imagem B e permaneceu livre de coágulos após nosso procedimento de isolamento com pico de sangue. As CEP aparecem após uma média de sete dias em cultura. Durante a realização do procedimento cirúrgico, é muito importante dissecar cuidadosa e gentilmente a VCI, pois mesmo o menor rasgo na VCI ou em seus ramos laterais pode levar à exsanguinação do porco. Após este procedimento, outros materiais em contato com o sangue podem ser rapidamente endotelializados para prevenir trombose.
Stents vasculares endoteliais, por exemplo, com nossas CEPs imitam o revestimento nativo da parede do vaso sanguíneo e podem prevenir a reestenose e a trombose do stent após seu desenvolvimento. Nossa tecnologia Quick See permitirá revestir dispositivos intravasculares com células progenitoras endoteliais derivadas do sangue do próprio paciente em minutos, na sala cirúrgica ou no laboratório de cateterização. Portanto, sem necessidade de cultivo prolongado ex vivo.
O tempo no próprio dispositivo é evitado e a tecnologia torna-se prática para a translação na prática clínica.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para semear biomateriais de titânio em contato com o sangue utilizando células progenitoras endoteliais autólogas (CPEs) a fim de melhorar a biocompatibilidade. A técnica envolve a semeadura rápida de CPEs em tubos de titânio imediatamente antes do implante cirúrgico nas veias cavas suínas, demonstrando potencial para diversos dispositivos biomédicos implantáveis.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia Biomédica
- Cirurgia Vascular
- Terapia Celular
Contexto
- As células progenitoras endoteliais (EPCs) podem ser derivadas do sangue próprio de um paciente.
- O uso de células autólogas reduz o risco de rejeição imunológica.
- A trombose é uma complicação significativa em implantes vasculares.
- Estudos anteriores demonstraram que as EPCs podem melhorar a biocompatibilidade de implantes.
Objetivo do Estudo
- Implantar células progenitoras endoteliais autólogas em implantes vasculares.
- Avaliar o efeito do tratamento com CPEs na trombose em um modelo animal de grande porte.
- Desenvolver uma tecnologia de semeadura celular que melhore o desempenho de dispositivos vasculares.
Métodos Utilizados
- Isolamento de EPCs porcinos de crescimento tardio a partir de amostras de sangue periférico.
- Seeding de tubos de titânio com EPCs antes do implante.
- Implante cirúrgico do tubo de titânio colonizado com EPCs na veia cava inferior do porco.
- Avaliação da trombose com base na perviedade do dispositivo implantado.
Resultados Principais
- O tubo de titânio semeado com CEP mostrou proteção contra trombose.
- Os resultados indicaram melhora na perviedade em comparação com os tubos de metal nu controle.
- O método demonstrou viabilidade para outros dispositivos implantáveis.
- A colaboração entre departamentos aprimorou os resultados da pesquisa.
Conclusões
- O revestimento de implantes de titânio com CEPs autólogas é uma abordagem promissora para reduzir a trombose.
- Essa técnica pode ser adaptada para diversos dispositivos biomédicos.
- São necessárias mais pesquisas para otimizar o método e avaliar os resultados a longo prazo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método aborda um desafio crítico no desenvolvimento de dispositivos cardiovasculares: complicações trombóticas decorrentes de superfícies artificiais em contato com o sangue. Ao permitir o revestimento rápido com células progenitoras endoteliais autólogas (EPC) em implantes de titânio imediatamente antes da implantação, a tecnologia oferece um caminho para melhorar a biocompatibilidade e reduzir o risco trombótico em testes pré-clínicos. A abordagem favorece a redução mecanicista de riscos em dispositivos vasculares ao fornecer um revestimento endotelial fisiologicamente relevante e derivado do paciente em um modelo animal de grande porte, aumentando assim a confiabilidade preditiva na avaliação precoce de dispositivos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos mecanismos trombogênicos por meio da comparação entre superfícies revestidas com CEP e superfícies de metal nu em um ambiente trombogênico.
- Valor Operacional: Fornece um modelo reprodutível para avaliar a eficiência da endotelização e a tromboresistência de biomateriais candidatos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas baseadas em fluorescência da cobertura endotelial e patência para triagem comparativa de dispositivos.
- Valor Operacional: Padroniza os procedimentos de semeadura de CEPs e implante para apoiar a transferência de ensaios com alta fidelidade entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra a formação de uma camada endotelial funcional e a manutenção da perviedade em um modelo animal grande clinicamente relevante.
- Valor Operacional: Conecta o preparo celular in vitro com testes de desempenho in vivo, permitindo decisões de avanço com ajuste de risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao apoiar a validação biológica inicial de materiais para dispositivos vasculares antes da identificação de compostos promissores e da otimização pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre estratégias de endotelização para reduzir o risco trombótico no design de dispositivos.
- Triagem: Permite a avaliação padronizada de modificações de superfície por meio de parâmetros quantificáveis, como cobertura endotelial e perviedade do dispositivo.
- Análises: Oferece quantificação baseada em fluorescência da cobertura por CEPs e da oclusão trombótica como indicadores comparativos principais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a obtenção autóloga de células com o desempenho do dispositivo em um modelo suíno de veia cava inferior, apoiando a continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar estratégias de endotelização em diversos tipos de dispositivos (por exemplo, stents, dispositivos de assistência).
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aprimora a validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em torno das interações sangue-dispositivo.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de isolamento, marcação e semeadura de CEPs.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao fornecer dados precoces de tromborresistência, reduzindo o risco de falha biológica em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a dispositivos com base no potencial de endotelização e nos perfis de biocompatibilidade.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura celular, marcação fluorescente e técnicas cirúrgicas vasculares.
- Depende de equipamentos estéreis para manipulação celular, incubadoras e microscopia de fluorescência para validação.
- Necessita padronização entre equipes de processamento celular e cirúrgicas para implantação em tempo hábil.
- A adaptação a biomateriais alternativos (por exemplo, nitinol, polímeros) pode exigir otimização da modificação de superfície.
- Limitado pelo tempo de cultura ex vivo para expansão de CEPs, que deve ser coordenado com o agendamento cirúrgico.
