Visualização do transporte intracelular de carga em astrócitos cultivados

Comece com uma cultura aderente de astrócitos primários de camundongos em uma lamínula dentro de um prato de cultura.

Incube com uma sonda acidotrópica fluorescente que atravessa as membranas celulares intactas para entrar nos astrócitos.

A sonda se acumula seletivamente dentro de vesículas endolisossômicas ácidas e marca fluorescentemente as vesículas para monitorar seu transporte.

Lave para remover o excesso de sonda e adicione meio fresco.

Coloque a cultura sob um microscópio confocal e concentre-se em uma única célula para realizar imagens de lapso de tempo.

Visualize a carga rotulada como pontos fluorescentes distribuídos na região perinuclear,

citosol e processos astrocíticos.

Capture vários planos focais ao longo do eixo Z para visualizar a carga em todo o volume tridimensional da célula.

Realize imagens em intervalos definidos para rastrear o transporte de carga intracelular em várias profundidades dentro dos astrócitos.

Analise o movimento da carga para distinguir entre carga estacionária, carga movendo-se em direção à periferia da célula e carga movendo-se em direção ao núcleo.

30 minutos antes da imagem, dilua uma sonda de marcação lisossômica adequada em 200 microlitros de meio