Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Este vídeo descreve um procedimento para gerar fibroblastos associados a carcinomas ou calfs a partir de cultura primária de células-tronco humanas. Os carcinomas são tecidos complexos compostos por células neoplásicas e um compartimento não canceroso denominado estroma. O estroma associado ao tumor S é constituído pela matriz extracelular e uma variedade de células estromais, incluindo fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliais, parasitas e leucócitos. Os fibroblastos associados ao carcinoma, ricos em miofibroblastos, são uma característica marcante de fibroblastos ativados presentes dentro do tumor.

Os estromócitos desempenham um papel fundamental na promoção da progressão tumoral. Eles podem ser gerados in vitro mediante o isolamento inicial de fibroblastos mamários humanos primários a partir de tecido mamário saudável obtido por mamoplastia redutora. O tecido obtido é dissociado em uma suspensão de células individuais, posteriormente imortalizado por transdução viral e modificado para expressar GFP e um gene de resistência à puromicina.

As células são então coinjetadas com carcinoma de mama humano. Células MCF seven RAs são injetadas subcutaneamente em um camundongo imunodeficiente. Os fibroblastos humanos injetados evoluirão para miofibroblastos do estroma tumoral promotores de tumor.

Em seguida, os fibroblastos mamários humorais parentais são extraídos de xenoenxertos tumorais e cultivados na presença de puromicina. As células resistentes à puromicina resultantes, denominadas fibroblastos carcaça gerados experimentalmente ou exp carcaça, revelam por meio de análise imuno-histoquímica que os fibroblastos humanos normais inicialmente presentes evoluem para fibroblastos carcaça dentro do xenoenxerto tumoral, adquirindo a capacidade de promover a tumorigênese. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a extração de carcaças primários de pacientes com câncer de mama, é que somos capazes de gerar experimentalmente carcaças a partir de fibroblastos mamários humanos utilizando o tumor de co-implantação.

O modelo geral que demonstrará o procedimento será Kar, um pesquisador pós-doutorando no meu laboratório, e Ahmed Kar, um estudante de doutorado do laboratório. Inicie com um grama de tecido mamário humano saudável dissecado a partir de uma mamoplastia redutora. Lave o tecido várias vezes em PBS, em seguida coloque o tecido em uma placa de Petri de 15 centímetros e use uma lâmina de barbear estéril para picá-lo em pequenos fragmentos com tamanho inferior a 1,5 milímetro cúbico.

Em seguida, utilize a lâmina de barbear para transferir os fragmentos de tecido para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de tampão de dissociação celular para cada meio grama de tecido. Em seguida, vortex por um minuto em velocidade máxima. Coloque o tubo em um agitador num incubador a 37 graus Celsius e deixe os fragmentos de tecido digerirem por 12 a 18 horas.

No dia seguinte, ainda haverá muitos pedaços de fragmentos de tecido não digeridos restantes no vórtex do tubo. Primeiro, em velocidade máxima, coloque o tubo sobre a bancada e incube por cinco minutos à temperatura ambiente sem agitação. Após a incubação, utilize uma pipeta fisiológica de cinco mililitros para transferir o sobrenadante enriquecido em células estromais resultante para um novo tubo cônico.

Em seguida, centrifugue a fração estromal por cinco minutos a 250 vezes a gravidade. Após a centrifugação, re-suspenda o pellet celular em PBS e, então, centrifugue a sua amostra por cinco minutos a 250 vezes a gravidade. Em seguida, re-suspenda o pellet em DMEM suplementado com 10% de FCS e transfira para uma placa de Petri de 15 centímetros.

Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após oito a 10 dias, as células devem estar confluentes. Neste ponto, as células são colhidas e podem ser congeladas para armazenamento de longo prazo.

Para imortalizar os fibroblastos humanos normais primários isolados, introduza um vetor retroviral P MIG expressando tanto H turt quanto GFP no cultivo celular por quatro a cinco dias e, em seguida, selecione as células GFP positivas utilizando citometria de fluxo. Introduza um construto retroviral P babe puro que codifica um gene de resistência à puromicina nos fibroblastos imortalizados marcados com GFP. Incube as células por cinco a sete dias na presença de puromicina numa concentração final de um micrograma por mililitro.

Para isolar os fibroblastos humanos de memória imortalizados resistentes à PUR micina marcados com GFP. Em seguida, verificar se os fibroblastos produzem vírus ativos, capazes de promover a transferência horizontal dos genes que codificam GFP e resistência à pur micina. Cultive 2,5 vezes 10 à quinta potência de fibroblastos humanos de memória imortalizados resistentes à pur micina em uma placa de Petri de seis centímetros por dois dias.

Colete e filtre o meio condicionado de fibroblastos utilizando um filtro de seringa com porosidade de 0,45 mícron. Em seguida, adicione a 10 t e meia células de fibroblastos de camundongo e cultive por 12 horas na presença de cinco microgramas por mililitro de sulfato de proteína, o que aumenta a eficiência da infecção viral após 12 horas. Troque o meio por DMEM suplementado com 10% de FCS e cultive por mais dois dias.

Examine as células por microscopia de fluorescência. Células T e meia infectadas pelo vírus GFP serão positivas para GFP. Agora, troque o meio para tratar as células com um micrograma por mililitro.

Selecione com puromicina por cinco a sete dias. Novamente, observe as células por microscopia de fluorescência para determinar se alguma das células resistentes à puromicina formou colônias. Observe que a transferência horizontal de genes por vírus ativos produzidos pelos fibroblastos mamários humanos parentais resistentes à puromicina e marcados com GFP pode tornar as células murínicas sensíveis à puromicina e as células de carcinoma circundantes resistentes.

Resistentes à puromicina e positivas para GFP dentro do xenoenxerto tumoral. Isso pode dificultar o processo de isolamento dos fibroblastos mamários humanos marcados com GFP e resistentes à puromicina injetados a partir do xenoenxerto tumoral, para geração experimental de fibroblastos associados ao carcinoma destinados à injeção em um camundongo imunodeficiente. Comece por trypsinizar e contar a linhagem celular mamária humana recém-preparada juntamente com a linhagem celular de carcinoma de mama humana MCF seven RAs em novos tubos de microcentrífuga.

Suspender novamente uma vez 1 × 10⁶ células de carcinoma de mama humano MC77H e três vezes 10⁶ fibroblastos mamários humanos imortalizados resistentes à puromicina marcados com GFP em 400 microlitros de meio de cultura com 50% de Matrigel por injeção. Colocar os tubos no gelo como controle.

Prepare também os mesmos fibroblastos mamários humanos sem as células MCF seven RAs. Em seguida, utilizando uma agulha de 27 gauge, injete a mistura celular em um sítio subcutâneo de um camundongo nu imunodeficiente para examinar a variação intratumoral dos fenótipos dos calfs. Isole os calfs e os fibroblastos controle de alguns xenoenxertos tumorais diferentes.

Em seguida, implante cada mistura nos lados direito e esquerdo de cada camundongo. Deixe os xenografos de tumor ou fibroblastos crescerem por 42 dias após a injeção. O período de incubação dos fibroblastos dentro do xenografo tumoral deve ser otimizado com base no fenótipo de miofibroblasto adquirido nos fibroblastos parentais no tumor.

Para extrair os fibroblastos de bezerro ou fibroblastos controle do camundongo eutanasiado, coloque em pratos separados pelo menos 0,5 gramas do tecido de xenotransplante e pelo menos 0,1 gramas do tecido de xenotransplante de fibroblastos. Em seguida, use uma lâmina de barbear estéril para picar o tecido em fragmentos pequenos com menos de 1,5 milímetro cúbico. Depois, use a lâmina de barbear para transferir os fragmentos de tecido para um tubo cônico de 15 mililitros contendo o tampão de dissociação celular e vortexie por um minuto em velocidade máxima. Incube a suspensão celular por três horas a 37 graus Celsius com agitação lenta contínua e, em seguida, centrifugue a suspensão celular.

Desagregue separadamente o tumor ou o enxerto de fibra de vidro sano durante cinco minutos a 250 vezes a gravidade após a centrifugação. Ressuspenda o pellet celular em PBS e repita a centrifugação. Em seguida, ressuspenda o pellet celular resultante em DMEM suplementado com 10% de FCS para isolar a cultura de fibroblastos mamários humanos parentais resistentes à puromicina.

As células derivadas do tumor ou fibroblastos flutuam em uma placa de Petri de 15 centímetros na presença de um micrograma por mililitro de puromicina, a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Isso eliminará quaisquer células de carcinoma contaminantes e/ou murinas.

As células estromais propagam as células até atingirem confluência e armazenam as células a menos 80 graus Celsius utilizando meio de congelação. Observe que as células resistentes à puromicina resultantes, designadas como células de fibroblasto de bezerro XP de 42 dias ou células de fibroblasto controle um, são imortais e positivas para GFP. Fibroblastos humanos de memória aumentam seu fenótipo miofibroblástico com atividade promovedora de tumor no enxerto heterotópico de tumor por meio da interação com células de carcinoma durante a progressão tumoral. Misture um vezes 10 à sexta potência de células MCF sete RAs e três vezes 10 à sexta potência de células P bezerro de 42 dias.

Uma célula em 400 microlitros de meio de cultura com injeção de 50% de Matrigel em um tubo eppendorf de 1,5 mililitro. Prepare também três vezes 10 à potência de 6 células de fibroblastos controle com 42 dias de idade, sem células de carcinoma, em um tubo eppendorf, para potencializar ainda mais os fenótipos miofibroblásticos promotores de tumor das células exp calf um. Injete uma mistura dessas células com células CF sete RAs subcutaneamente em um camundongo nu. Injete também as células de fibroblastos controle um isoladamente, sem células cancerígenas, para preparar as células controle, se necessário.

Incube as células exp calf uma por períodos adicionais de 200 dias dentro do xenoenxerto tumoral para gerar as células exp C duas e potencializar o fenótipo miofibroblástico promotor de tumor. Também gere as células controle fibroblastos duas como controle frente às células exp calf duas, injetando as células controle fibroblastos uma sem células carcinomatosas em um camundongo, remova os tumores e coloque-os em placas de cultura de tecidos.

Disseque e dissocie o tumor ou enxerto de fibroblastos senescentes em uma suspensão unicelular e cultive as células em uma placa de Petri de 15 centímetros com DMEM contendo 10% de FCS na presença de puromicina. Propague as células até que estejam prontas para a trypsinização completa e armazene as células a -80 graus Celsius utilizando meio de congelação. As células resultantes resistentes à puromicina são denominadas células exp-calf-2 com 242 dias ou células controle fibroblastos-2. Células exp-calf-2 e fibroblastos-2 controle marcadas com GFP, extraídas de enxertos xenogênicos de tumor de mama, foram analisadas imuno-histoquimicamente. Conforme mostrado nesta imagem, as células apresentam coloração fortemente positiva para marcadores mesenquimais, incluindo a prolina 4-hidroxilase específica para humanos, colágeno tipo I, fibronectina, S100A4 e proteína de superfície dos fibroblastos.

Esses resultados indicam uma origem humana e natureza mesenquimal dessas células. Em contraste, a citoceratina, um marcador para células epiteliais, não foi detectada nessas fibroblastos GFP-positivos consideradas em conjunto. Essas descobertas sugerem que as células EXP C dois e os fibroblastos controle dois são originários dos fibroblastos mamários humanos parentais inicialmente introduzidos em xenografias murinas.

É importante destacar que números muito maiores de células XP calf dois apresentaram coloração positiva para alfa-SMA e para a glicoproteína da matriz extracelular nesina C, ambas marcadoras de miofibroblastos, em comparação com fibroblastos controle dois. Observe que uma proporção maior de miofibroblastos positivos para alfa-SMA está presente nas células exp calf dois em comparação com a observada nas células exp calf um de 42 dias. Esses dados demonstram que fibroblastos residentes humanos de memória progridem progressivamente para miofibroblastos do tipo calf dentro de xenoenxertos tumorais durante a progressão tumoral após seu desenvolvimento.

O modelo de xenoenxerto tumoral de complementação abriu caminho para pesquisadores que estudam o microambiente tumoral, permitindo investigar os processos de evolução do fibroblasto normal em câncer. Assim dizem os fibroblastos.