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$$\longrightharp{xx}$$,
Comece com um software de microscópio confocal e defina os parâmetros de aquisição de imagem.
Em seguida, pegue uma seção do cérebro do rato montada em uma lâmina de vidro. Esta seção está corada com anticorpos direcionados aos componentes da barreira hematoencefálica.
A barreira hematoencefálica é uma interface celular seletiva entre a corrente sanguínea e o cérebro para manter a homeostase.
Aplique uma gota de óleo de imersão com o índice de refração desejado na lamínula para otimizar a resolução e minimizar a refração da luz.
Coloque a lâmina no microscópio stage e use a lâmpada de epifluorescência para visualizar a amostra.
Usando os filtros apropriados, localize os núcleos corados com DAPI e identifique o segmento capilar para imagem.
Inicie a varredura ao vivo e ajuste os parâmetros de cada canal fluorescente para capturar imagens de alta qualidade.
Por fim, defina os pontos inicial e final da aquisição da pilha Z para gerar uma imagem tridimensional da barreira hematoencefálica.
No menu Aquisição do software que controla o microscópio, defina os parâmetros de aquisição de imagem. No menu suspenso de tamanho da imagem, selecione um valor de 1.024 por 1.024 pixels. Modifique o tamanho do pixel para um valor entre 200 e 300 nanômetros ajustando o valor do menu Zoom.
No menu suspenso Velocidade de aquisição, selecione um valor de 400 hertz. Em seguida, no menu Configurações do sistema, selecione a profundidade do pixel e altere o valor para 12 bits. Em seguida, no software do microscópio, na guia Aquisição, ative a opção de aquisição sequencial de quadros. Defina a espessura da seção óptica para um valor entre 0,75 e 1 micrômetro para cada canal, modificando o valor no menu Pinhole.
Adicione uma gota de óleo de imersão com um índice de refração de 1,52 no topo da lamínula, com a seção do cérebro para corresponder ao índice de refração da lamínula de vidro e da objetiva. Em seguida, coloque a amostra no microscópio e ligue a lâmpada epifluorescente para visualizar a amostra usando os binóculos do microscópio. Em seguida, pressione o botão para iniciar o modo de varredura ao vivo. Durante a digitalização, ajuste o ganho e a intensidade do laser para cada canal para maximizar a faixa dinâmica das imagens e evitar a saturação de pixels. Em seguida, estabeleça as seções inicial e final para realizar pilhas Z ópticas que abrangem todo o volume do capilar e use um tamanho de passo de 0,45 micrômetros.
É importante ressaltar que todas as configurações de aquisição devem ser mantidas idênticas durante a sessão de imagem.