Imagem de receptor de estrogênio α-in Rat Arteríolas Pial usando um Microscópio Digital imunofluorescência
29 de novembro de 2011
O objetivo deste artigo é demonstrar um método para otimizar a detecção de imunofluorescência de receptor de estrogênio α (ERα) em ratos pial fatias arterial utilizando um microscópio digital de imunofluorescência.
O objetivo geral deste procedimento é descrever uma técnica simples para otimizar a coloração e a visualização do receptor de estrogênio alfa utilizando fatias transversais de artérias da túnica elástica obtidas de cérebros de ratas. Isso é realizado primeiramente removendo as artérias da túnica elástica previamente coradas com azul de Evans da superfície do cérebro e cortando-as em anéis de oito mícrons usando um criostato após o corte. As seções transversais são montadas em lâminas e incubadas com o anticorpo primário contra o receptor de estrogênio alfa.
Em seguida, os cortes são incubados com o anticorpo secundário e contra-coloridos utilizando meio de montagem contendo dpi. Por fim, os segmentos de vaso descamado marcados com fluorescência são imagiados e convertidos em imagens 2D usando software de foco com profundidade estendida. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o receptor de estrogênio alfa em arteríolas descamadas por meio de um microscópio imunofluorescente Nikon com software de profundidade estendida.
Meu nome é Dra. Marguerite Littleton Kearney. Hoje, o Dr. Neil Farani, pesquisador pós-doutorando no meu laboratório, demonstrará um procedimento simples para otimizar a visualização e coloração do receptor de estrogênio alfa em pele.
Artérias torácicas de um cérebro de rato que foi perfundido com corante azul de Evans e armazenado a menos 70 graus Celsius. Utilizando um microscópio estereoscópico, identifique as artérias da superfície do cérebro e remova-as com pinças de ponta fina. Remova cuidadosamente qualquer tecido cerebral aderente.
Coloque as artérias em um pequeno tubo de ensaio sobre gelo. Fixe as artérias em formaldeído a 2% frio em 0,1 mol de PBS por 30 minutos. Para preparar as artérias para o corte, despeje o meio de inclusão sobre um disco congelador ajustado a menos 20 graus Celsius.
Coloque um segmento de artéria sobre o chug e aguarde até que congele. Após congelar firmemente, posicione a artéria na posição vertical em meio de inclusão sobre o disco congelador do criostato. Certifique-se de que a extremidade da artéria esteja voltada para frente.
Segure a artéria com pinças até que ela congele completamente. Coloque o disco de congelamento com a artéria na cabeça do criostato e, em seguida, corte anéis arteriais de oito mícrons diretamente sobre uma lâmina. Monte as secções arteriais em gelatina de cromo potássico.
Deslize as lâminas usando dois pincéis para alinhar os anéis arteriais. Armazene as lâminas preparadas em uma caixa de lâminas na geladeira a quatro graus Celsius durante a noite. Retire as lâminas da geladeira e deixe-as atingir a temperatura ambiente sobre a bancada.
Lave as lâminas com um a 1,5 mililitros de PBS 0,1 molar. Após 10 minutos, remova o PBS e repita o procedimento mais duas vezes. Após a lavagem final com PBS, incube as lâminas em um mililitro de cloreto de amônio 50 milimolar por 30 minutos à temperatura ambiente, a fim de reduzir a fluorescência endógena. Lave as lâminas com PBS 0,1 molar três vezes, com 10 minutos por lavagem, conforme descrito anteriormente. Em seguida, bloquee as lâminas em uma solução de PBS contendo 0,1% de Triton X-100 mais 1% de soro de cabra normal por 30 minutos para reduzir a ligação não específica do anticorpo primário.
Após o bloqueio, incubar as lâminas com o anticorpo primário contra ER alfa diluído na concentração de 1:500 na solução de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius. Remover as lâminas do refrigerador e levar até a temperatura ambiente. Lavar o anticorpo primário não ligado com 1 a 1,5 mililitros de PBS 0,1% três vezes por 10 minutos.
A cada vez, incube os lâminas com o anticorpo secundário anti-coelho Oregon Green 488 na solução bloqueadora por duas horas no escuro e à temperatura ambiente. Após a incubação, lave os lâminas em PBS 0,1 molar três vezes, com 10 minutos por lavagem, e então leve-os para uma cabine de exaustão ventilada. Coloque uma gota de meio de montagem contendo DAPI sobre as amostras e, em seguida, posicione uma lamínula sobre a amostra. Aplique esmalte incolor para selar as bordas da lamínula e deixe secar completamente.
Insira as lâminas preparadas com os segmentos de vaso da casca corados sob o microscópio e ajuste para visualizar as áreas de interesse marcadas com fluorescência. A visualização do ER alfa corado é a etapa mais difícil deste procedimento. Encontre o plano do vaso cortado com os receptores mais nítidos.
Inicie com uma ampliação de 100 vezes e, em seguida, aumente a ampliação para 600 vezes. Use a câmera para capturar imagens nos canais DPI e ZI para os núcleos celulares e DR alfa, respectivamente, e depois use um software para converter múltiplas visualizações de segmentos de vaso em imagens 2D. Aqui, os resultados da coloração por imunofluorescência para ER alfa são mostrados em verde e a contra-coloração com DPI.
Em azul, em um anel de artéria peel isolado do cérebro de uma rata, as imagens sobrepostas sugerem a presença de receptor de estrogênio alfa intranuclear. Ao utilizar uma combinação de imagens Zack, pode-se obter uma imagem nítida da imunofluorescência do ER alfa, levando em consideração controles negativos de autofluorescência; devem ser realizados controles negativos tanto para o anticorpo primário quanto para o secundário. Observe a autofluorescência distinta ao longo do lado endotelial de uma artéria que não foi incubada com o anticorpo secundário.
Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como isolar e remover as artérias da superfície do cérebro, além de preparar anéis transversais de oito mícrons. Além disso, você deverá estar familiarizado com o uso do receptor de estrogênio alfa marcado com fluorescência e com a visualização dos receptores por meio de um microscópio digital de imunofluorescência e do software estendido da Nikon.
Visão Geral
Este artigo demonstra um método para otimizar a detecção por imunofluorescência do receptor de estrogênio-α (ERα) em cortes arteriais piais de ratos. A técnica envolve a preparação e visualização de cortes transversais de cérebros de ratas fêmeas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Imunofluorescência
- Biologia Celular
Contexto
- O receptor de estrogênio-α desempenha um papel crucial em diversos processos fisiológicos.
- A imunofluorescência é uma técnica fundamental para visualizar proteínas específicas em tecidos.
- As artérias piais de rato são importantes para o estudo do fluxo sanguíneo cerebral e das funções neurovasculares.
- A otimização das técnicas de coloração melhora a clareza dos resultados de imagem.
Objetivo do Estudo
- Descrever uma técnica simples para visualizar ERα em artérias piais de ratos.
- Melhorar a precisão da imagem imunofluorescente.
- Fornecer um método reprodutível para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Isolamento de artérias piais de cérebros de ratos utilizando corante azul de Evans.
- Seccionamento das artérias em anéis de oito mícrons usando um criostato.
- Incubação com anticorpos primários e secundários para detecção de ERα.
- Obtenção de imagens usando um microscópio imunofluorescente Nikon com software de profundidade estendida.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de ERα em cortes arteriais piais.
- Imagem nítida de ERα marcado fluorescentemente e coloração de contraste.
- Demonstração da presença de ERα intranuclear nas amostras.
- Identificação de autofluorescência em amostras controle.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para o estudo de ERα em tecidos vasculares.
- A coloração otimizada melhora a visualização de proteínas específicas.
- Essa técnica pode ser adaptada para diversas aplicações de pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização confiável do receptor de estrogênio-α em tecidos vasculares, apoiando a validação de alvos na pesquisa neurovascular. Ao otimizar a coloração e a imagem por imunofluorescência, aumenta a confiança preditiva em estudos mecanicistas das respostas vasculares mediadas por hormônios. A abordagem oferece uma alternativa economicamente viável à microscopia confocal para a redução de riscos de alvos em estudos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor científico: Permite a investigação da localização de ERα nas camadas musculares lisas e endoteliais das arteríolas piais.
- Valor operacional: Utiliza corte em seções transversais para esclarecer a distribuição do receptor nos planos vasculares.
- Valor científico: Apoia a desmistificação biológica ao confirmar a presença do receptor nos núcleos e no citoplasma.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz seções transversais padronizadas de 8 μm para preparação consistente de ensaios de imunofluorescência.
- Valor Operacional: Permite a obtenção de imagens de fluorescência quantitativas por meio de microscópio digital de imunofluorescência com software de profundidade estendida.
- Valor Científico: Facilita protocolos de coloração reprodutíveis, reduzindo a variabilidade na detecção de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece um modelo vascular relevante para doenças, útil no estudo dos efeitos cerebrovasculares mediados por ERα.
- Valor Operacional: Permite a visualização de ERα intranuclear para apoiar o alinhamento de biomarcadores mecanicistas.
- Valor Científico: Permite a avaliação ajustada ao risco de ERα como alvo em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa técnica se insere nos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer um preparo validado de tecido vascular para estudos de engajamento de alvo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função do ERα na regulação do fluxo sanguíneo cerebral.
- Triagem: Fornece seções padronizadas de tecido que permitem leituras reprodutíveis por imunofluorescência.
- Análises: Gera dados quantitativos de fluorescência nos canais DPI e FITC para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a validação de alvos vasculares à continuidade pré-clínica em modelos neurovasculares.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para visualização de alvos vasculares em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva do ERα como alvo vascular por meio da localização subcelular clara.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de um protocolo padronizado de corte em criostato e coloração.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao reduzir a ambiguidade mecanicista na validação do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos moduladores do ERα com base no engajamento do alvo vascular.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos, corte em criostato e coloração por imunofluorescência.
- Depende de microscópio digital de imunofluorescência com software de foco de profundidade estendida e conjuntos de filtros apropriados.
- Necessita padronização das concentrações de anticorpos, condições de bloqueio e etapas de lavagem entre as equipes.
- A adaptação a outros leitos vasculares pode exigir otimização da espessura dos cortes e da recuperação de antígenos.
- Limitado pela autofluorescência do tecido, exigindo controles adequados conforme demonstrado no protocolo.
