Name: Imagem de receptor de estrogênio α-in Rat Arteríolas Pial usando um Microscópio Digital imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a otimizar a detecção imunofluorescente do receptor de estrogênio-α em artérias piais de ratas usando microscopia digital. Este método confiável permite visualizar ERα intranuclear em tecidos vasculares cerebrais.

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O trabalho para este projeto foi suportado por concessões do National Institutes of Health R01-NR5339 e da Universidade Militar de Ciências da Saúde-R061LD.

1. Isolamento e preparação de Artérias Pial <ol><li> Enquanto o rato é inserir anestesiados e segura de um cateter em uma artéria e perfundir com 1% de azul de Evans em 1X PBS. Vasos Pial mancha bem com o corante azul de Evans tornando-os mais fáceis de isolar. </li><li> Extrair o cérebro e armazenar a -70 ° C até serem necessárias. Idealmente, o cérebro deve ser armazenado no máximo 2 meses. </li><li> Usando um microscópio de dissecação remover arteríolas pial (média de diâmetro 35-50 mm) da superfície do cérebro. Retire cuidadosamente todas as arteríolas azul manchado de dorsal e lateral da superfície do córtex usando uma pinça de ponta fina. Remover o tecido cortical aderente excesso antes de colocar no fixador. </li><li> Corrigir as arteríolas colhidas em 2% paraformaldeído em 0,1 M PBS fria por 30 min. </li><li> Para preparar as arteríolas para seccionamento derramar meio de incorporação sobre o congelamento do disco / chuck (set a -20 ° C). </li><li> Seção lugar arteríola plana sobre o mandril umand esperar para congelar. Firmemente colocar o navio-up diretamente no disco congelamento criostato sobre a incorporação da mídia com a ponta da artéria voltado para você. Segure-o com uma pinça até que ela está solidamente congelado. </li><li> Coloque o disco de congelamento com o vaso na cabeça criostato e cortar 8 mM anéis arteríola pial com o criostato. </li><li> Montagem das seções arteríola em cromo-potássio-gelatina slides subbed. </li><li> Armazenar as lâminas preparadas em uma caixa de lâminas na geladeira a 4 ° C durante a noite. </li></ol> 2. ER-α coloração imunofluorescência 1 dia <ol><li> Remover os slides da geladeira; trazer cada à temperatura ambiente. </li><li> Para lavar os slides derramar 1-1,5 ml 0,1 M PBS (o suficiente para cobrir todas as seções) deixe descansar por 10 minutos, escorra e repita o procedimento mais duas vezes. Cada borda do slide tem um marcador hidrofóbicas. Conseqüentemente, o líquido permanece na superfície da lâmina. Com cada lavagem o líquido é derramadopara fora e substituído por novas 0,1 M PBS. </li><li> Incubar as lâminas em 1 ml de cloreto de amônio 50 mM por 30 min em temperatura ambiente para reduzir a fluorescência endógena. </li><li> Lavar as lâminas em 0,1 M min 3x10 PBS. como descrito em 2.2 </li><li> Slides bloco em 0,1% Triton X-100 mais 1% de soro de cabra normal (NGS), em PBS por 30 min. para reduzir a ligação não específica. </li><li> Incubar as amostras com o anticorpo primário (coelho policlonal anti-ER-α; 1:500) em PBS + 0,1% Triton-X + NGS 1% durante a noite a 4 ° C. </li></ol> Dia 2 <ol start="7"><li> Remover os slides da geladeira; trazer cada à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas em 0,1 M min 3x10 PBS. como descrito em 2.2 </li><li> Incube com Oregon Verde 488 secundário anti-coelho na NGS 1% 0,1% Triton-X100 + PBS por 2 horas no escuro a temperatura ambiente. A partir deste passo, os próximos passos devem ser feitas no escuro. </li><li> Lavar as lâminas em 0,1 M min 3x10 PBS. como descrito em 2.2 </li><li> Sob uma vecapa ntilated, gota coloque 1 de 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), mais meios de montagem de vasos e em seguida, coloque uma lamínula sobre a amostra. </li><li> Aplicar unha clara polonês para selar as bordas da lamínula. Não mova os slides até que esteja completamente seco, o que leva aproximadamente 24 horas. </li></ol> 3. Fluorescência de Imagem Digital <ol><li> Para imagens de ER-α no vaso pial fatia usamos uma Nikon Eclipse 80i microscópio digital fluorescentes com filtros de 3 cores (azul, verde e vermelho) equipado com uma câmera digital. </li><li> Inserir os slides preparados com o manchado segmentos de navios pial sob o microscópio e ajustar para visualizar as áreas de interesse fluorescente etiquetado. Iniciar com ampliação de x100 x600, em seguida, aumentar para ampliação. </li><li> Use a câmera para capturar imagens em DAPI (azul) e (verde) FITC canais de núcleos celulares (DAPI) e ER-α (Oregon Green) usando software Nikon Foco Extended Profundidade para converter visão múltiplas de segmentos de navios em imagens 2-D. </li></ol> 4. Resultados representativos: Nós localizada receptor de estrogênio α-in pial vasos arteriais utilizando sondas fluorescentes e otimizado nossa visualização do receptor usando microscopia de fluorescência digital. Para detectar a presença do receptor, um anticorpo policlonal de coelho primário e um verde Oregon 488 anticorpo marcado secundário foi utilizado para a imagem dos receptores nas artérias pial isoladas a partir da superfície do cérebro. Além disso, uma mancha nuclear (DAPI) foi utilizado para identificar o núcleo das células e determinar se pudéssemos detectar receptores localizados no núcleo desde ER-α tem sido relatada a estar presente na cyotosol celular e do núcleo. Além disso, realizamos experimentos de confirmação para validar a especificidade do anticorpo primário e verificar ligação do secundário ao anticorpo primário. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Coloração imunofluorescência para ER-α (verde) e contracoloração com DAPI (azul) em um anel de artéria pial isolado de cérebro de rato fêmea. Fig. 1A mostra as imagens fundidas, sugerindo a presença de alguns estrogênio receptor intranuclear-a. (Seta) Fig. 1B e 1C são a imagem focalizada de ER-α, que é uma combinação de Z-stack imagens. Imagens foram tiradas no x600 e ampliação são de cortar o anel do mesmo navio em diferentes planos. Setas indicam receptor de estrogênio α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Coloração imunofluorescência para grupos de controle em um anel de artéria pial isolado de cérebro de rato fêmea. Fig. 2D mostra o navio sem o anticorpo primário. Fig. 2E mostra o navio sem o anticorpo secundário (autofluorescência nota distintas ao longo do lado endotelial). Imagens foram tiradas no x600 e ampliação são de cortar o anel do mesmo navio em difereaviões nt.

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</ol>

As opiniões expressas são de responsabilidade dos autores e não refletem a política ou posição oficial da Universidade Militar de Ciências da Saúde, o Departamento de Defesa, ou o governo dos Estados Unidos.

Anteriormente, mostrou que, após lesão cerebral isquêmico transitório mundial a capacidade da artéria pial para mudar o diâmetro em resposta a ambos os vasodilatadores 7, 8 e 9 vasoconstritores é marcadamente deprimido em jovens ratas ovariectomizadas. Reposição estrogênica crônica restaura respostas vasomotoras 7-9. Além disso, reposição de estrogênio atrasada reverte os efeitos benéficos do estrogênio sobre a capacidade da artéria pial vasodilatador 10 levando-nos a questionar se a longo prazo a depleção de estrogênio afeta ER-α densidade na cerebrovasculature. Nós planejamos usar a rotulagem de imunofluorescência combinado com western blotting para avaliar mudanças na ER-α expressão em resposta à depleção de estrogênio crônica. Porque tivemos alguma dificuldade na visualização de grupos distintos de receptores que modificou o método que demonstramos aqui. Portanto, o nosso principal objetivo neste estudo foi a primeira a desenvolver um método relativamente simples para otimizar o visualização dos receptores nas arteríolas pial. De acordo com vários relatos 6,11,12 achamos necessário fazer ajustes para o tipo de tecido que estávamos investigando, a espessura da amostra, a distribuição de ER-α no reservatório, bem como o grau de ligação não específica . Nosso método é muito eficaz para visualizar a presença de ER-α em fatias navio pial. Mas como outros já anteriormente apontado o uso bem sucedido desses métodos é altamente dependente da especificidade e concentrações dos anticorpos, a localização subcelular das proteínas de fixação de juros, e protocolos de bloqueio e manipulação de tecidos 12. Antes de visualização de preparações nossa embarcação que passou um tempo para trabalhar fora todas estas variáveis. Temos como destaque precisávamos ajustar algumas da nossa abordagem neste artigo. Partimos para otimizar a visualização ER-α nas arteríolas pial e este apresentou alguns desafios.Primeiro, o tamanho médio de uma artéria de ratos pial é entre 35-50 mM fazer isolamento e remoção da superfície do cérebro um pouco complicado. Descobrimos que a perfusão com Evans blue dye antes do sacrifício torna a dissecção das artérias mais fácil. Evan azul pode afetar de fluorescência, mas sentimos que a vantagem de usar este corante superam as suas desvantagens menor. Em nosso protocolo os vasos são lavadas várias vezes. Isso minimiza o corante residual nos vasos e reduz os possíveis efeitos do corante em fluorescência. Outra dificuldade que encontramos foi a de que a espessura dos segmentos navio pial fez clara visualização dos receptores difícil. Além disso, não poderíamos obter imagens particularmente claro provavelmente devido ao fato de que ER-α foi espalhadas várias camadas de células. Nós tentamos trabalhar com fatias navio longitudinal (como outros), mas devido ao pequeno tamanho pial era difícil lidar com os navios e evitar torção dos vasos durante a montagemem lâminas, mesmo usando um microscópio. Finalmente, conseguimos a nossa técnica modificada usando um criostato e corte o vaso cruz-sábio em a 8 anéis mm de espessura. Os anéis são mais fáceis de manusear e várias podem ser montados em um slide. Uma vez que adquiriu os vasos que sentiu a necessidade de testar a eficácia do primeiro flash congelamento do tecido, em seguida, fixar os vasos como sugerido por Danseshatalb e associados 11. Embora não tenhamos encontrado imunofluorescência fundo um pouco menos, também observou que os receptores manchada menos intensamente tornando a visualização dos receptores mais difícil. Conseqüentemente, nós preferimos primeiro a congelar o cérebro inteiro e armazenar até que seja necessário (geralmente entre 1-2 meses). Em seguida, retire os vasos, como descrito e corrigir os vasos antes de cortar com o criostato. como demonstramos aqui. Um passo necessário é para executar os controles com os dois principais eo anticorpo secundário separadopara determinar a especificidade e imunofluorescência fundo. Receptor de estrogênio α-anticorpos pode ser difícil de trabalhar. Na verdade, tentamos três diferentes anticorpos primários (monoclonal 1 e 2 policlonal) antes estávamos satisfeitos com o sucesso de nossa coloração receptor. Como parte de nossos controles, primeiro verificou a especificidade do anticorpo primário por omissão da adição do anticorpo primário. Figura 2D mostra o navio sem o anticorpo primário. Não há coloração e apenas um sinal de fundo pouco. Uma vez que o anticorpo primário policlonal é, há alguma coloração de fundo difusa não-específicas. Em segundo lugar, acrescentou o anticorpo primário, mas não o anticorpo secundário (Fig. 2E). Pode-se ver uma boa margem representando o autofluoresence ao longo das fronteiras endotelial dos vasos. Isto é consistente com a obra de Dan e associados 5. No entanto, nem os pequenos pontos de imunofluorescência que representam ER-α, nem a ref aparência granularselecionar as presença de receptores numerosos podem ser detectadas sem a combinação de ambos os anticorpos primário e secundário. Observamos um padrão distinto de autofluoresence ao longo das margens endotelial dos vasos. Estes testes independentes para a especificidade de anticorpos são importantes, pois confirmam a especificidade do anticorpo para o ER-α eo anticorpo secundário liga-se ao primário. Em conclusão, como demonstrado por outros 4, 5 vasos sanguíneos do cérebro contêm numerosos ER-α sub-tipo de receptores. Em nossas mãos, preparando 8μm cruz fatias seccional de artérias isoladas pial aumenta coloração e visualização dos receptores. Métodos tradicionais usam microscopia confocal para examinar as amostras. Ter a capacidade de ver seriados óptica a partir de amostras de espessura é um benefício importante da microscopia confocal. No entanto, a compra de um microscópio confocal boa pode ser muito caro. Usando software Extended Profundidade (FED), descobrimos quepoderia reduzir nossos custos de equipamento. Usando um microscópio de fluorescência com a EDF foram obtidas imagens claras e são capazes de visualizar pial arterial ER-α em vários níveis usando Z-stacks. Um benefício significativo do software FED é que ela permite captura de imagem de forma a efetivamente criar uma imagem 3-D a partir das imagens. Para laboratórios que não têm acesso a um microscópio confocal ou os fundos para comprar um microscópio fluorescente digitais com software apropriado pode ser uma opção prática e menos onerosa, dependendo dos objetivos do pesquisador.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Azul de Evans </td><td> Sigma </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Sigma </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Compound outubro </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Cloreto de amônio </td><td> Sigma </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER-α anticorpo policlonal de coelho </td><td> Santa Cruz </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> Oregon verde 488 de cabra anti IgG de coelho </td><td> Invitrogen </td><td> O-11038 </td></tr><tr><td> Vectashield montagemmeio para fluorescência com DAPI </td><td> Vector Lab </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

imagem de receptor de estrogênio α-in rat arteríolas pial usando um microscópio digital imunofluorescência

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Muitos dos efeitos do estrogênio sobre a reatividade vascular são mediados através da interação com receptores de estrogênio 1, 2, 3. Apesar de dois sub-tipos de existir (receptor de estrogênio α e β), receptor de estrogênio α-foi identificado em ambos os músculos do suave e nas células endoteliais da pial segmentos arteriais usando coloração fluorescente combinada com microscopia confocal a laser de varredura 4. Além disso, ER-α está localizado no núcleo e no citoplasma das artérias basilar de ratos 5. Os receptores são abundantes e apresentam forte fluorescência, mas clara visualização de grupos distintos de receptores é difícil provavelmente devido ao número de camadas de células localizadas em muitos dos segmentos de navios pial. Além disso, muitos relatórios utilizando técnicas de imuno-histoquímica emparelhado com microscopia confocal mal detalhe os requisitos críticos para a reprodução de experiências 6. Nosso propósito para este artigo é descrever uma técnica simples para otimizar tele coloração e visualização de ER-α usando transversal fatias de arteríolas pial obter cérebros de ratos do sexo feminino. Nós primeiro perfundir ratos com Evans corante azul para identificar facilmente artérias superfície pial que isolar sob um microscópio de dissecação. Uso de um criostato de cortar 8 mM seções transversais das artérias nos permite obtenção de cortes finos vasos de modo que os aviões navio diferentes são mais bem visualizados. Cortando o navio em vez de usar de um segmento de pequenos vasos tem a vantagem de facilitar a visualização das camadas endoteliais e musculares lisas. Além disso, o uso de um microscópio de imunofluorescência digitais com software prorrogado profundidade produz imagens claras de 10-12 aviões navio diferente e é menos dispendioso do que o uso de um microscópio confocal de varredura a laser.

O objetivo deste artigo é demonstrar um método para otimizar a detecção de imunofluorescência de receptor de estrogênio α (ERα) em ratos pial fatias arterial utilizando um microscópio digital de imunofluorescência.

Imagem de receptor de estrogênio α-in Rat Arteríolas Pial usando um Microscópio Digital imunofluorescência

Muitos dos efeitos do estrogênio na reatividade vascular são mediados por meio da interação com os receptores de estrogênio 1, 2, 3. Embora existam dois subtipos (estrogênio ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever uma técnica simples para otimizar a coloração e a visualização do receptor de estrogênio alfa utilizando fatias transversais de artérias da túnica aracnoidea obtidas de cérebros de ratas. Isso é realizado primeiramente removendo as artérias da túnica aracnoidea coradas com azul de Evans da superfície do cérebro e cortando-as em anéis de oito mícrons usando um criostato após o corte em fatias. As seções transversais são montadas em lâminas e incubadas com o anticorpo primário contra o receptor de estrogênio alfa.Em seguida, os cortes são incubados com o anticorpo secundário e contra-coloridos utilizando meio de montagem contendo dpi. Por fim, os segmentos de vaso descamados marcados com fluorescência são visualizados e convertidos em imagens 2D usando software de foco de profundidade estendida. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o receptor de estrogênio alfa em arteríolas descamadas por meio de um microscópio Nikon de imunofluorescência com software de profundidade estendida.Meu nome é Dra. Marguerite Littleton Kearney. Hoje, o Dr. Neil Farani, pesquisador pós-doutorando no meu laboratório, demonstrará um procedimento simples para otimizar a visualização e coloração do receptor de estrogênio alfa em pele.Artérias torácicas de um cérebro de rato que foi perfundido com corante azul de Evans e armazenado a menos 70 graus Celsius. Utilizando um microscópio estereoscópico, identifique as artérias da superfície do cérebro e remova-as com pinças de ponta fina. Remova cuidadosamente qualquer tecido cerebral aderente.Coloque as artérias em um pequeno tubo de ensaio sobre gelo. Fixe as artérias em formaldeído a 2% frio em 0,1 mol de PBS por 30 minutos. Para preparar as artérias para o corte, despeje o meio de inclusão em um disco de congelação ajustado a menos 20 graus Celsius.Coloque um segmento de artéria plano sobre o chug e aguarde até que congele. Uma vez que tenha congelado firmemente, posicione a artéria na posição vertical em meio de inclusão sobre o disco congelante do criostato. Certifique-se de que a ponta da artéria esteja voltada para frente.Segure a artéria com pin&ccedil;as at&eacute; que ela congele completamente. Coloque o disco de congelamento com a art&eacute;ria na cabe&ccedil;a do criostato e, em seguida, corte an&eacute;is arteriais de oito m&iacute;cron diretamente sobre uma l&acirc;mina. Monte as se&ccedil;&otilde;es arteriais em gelatina de cromo pot&aacute;ssico.Posicione as lâminas com auxílio de dois pincéis para alinhar os anéis arteriais. Armazene as lâminas preparadas em uma caixa de lâminas no refrigerador a quatro graus Celsius durante a noite. Retire as lâminas do refrigerador e deixe-as atingir a temperatura ambiente sobre a bancada.Lave as lâminas com um a 1,5 mililitros de PBS 0,1 molar. Após 10 minutos, remova o PBS e repita o procedimento mais duas vezes. Após a lavagem final com PBS, incube as lâminas em um mililitro de cloreto de amônio 50 milimolar por 30 minutos à temperatura ambiente, com o objetivo de reduzir a fluorescência endógena. Lave as lâminas em PBS 0,1 molar três vezes, com 10 minutos por lavagem, conforme descrito anteriormente. Em seguida, bloquee as lâminas em uma solução de PBS contendo 0,1% de Triton X-100 e 1% de soro normal de cabra por 30 minutos para reduzir a ligação inespecífica do anticorpo primário.Após o bloqueio, incubar as lâminas com o anticorpo primário contra ER alfa diluído na concentração de 1:500 na solução de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius. Remover as lâminas do refrigerador e levá-las à temperatura ambiente. Lavar o anticorpo primário não ligado com 1 a 1,5 mililitros de PBS 0,1% três vezes por 10 minutos.A cada vez, incube os lâminas com Oregon Green, 4 88 anticorpo secundário anti coelho na solução bloqueadora por duas horas no escuro e à temperatura ambiente. Após a incubação, lave os lâminas em PBS 0,1 molar 3 vezes, com 10 minutos por lavagem, e então leve-os para uma capela ventilada. Coloque uma gota de meio de montagem contendo dappy sobre as preparações e, em seguida, posicione uma lamínula sobre a amostra. Aplique esmalte incolor para selar as bordas da lamínula e deixe secar completamente.Insira as lâminas preparadas com os segmentos de vaso do limão corados sob o microscópio e ajuste para visualizar as áreas de interesse marcadas com fluorescência. A visualização do ER alfa corado é a etapa mais difícil deste procedimento. Encontre o plano do vaso cortado com os receptores mais nítidos.Inicie com uma ampliação de 100 vezes e, em seguida, aumente a ampliação para 600 vezes. Utilize a câmera para capturar imagens nos canais DPI e ZI para os núcleos celulares e DR alfa, respectivamente, e depois use um software para converter múltiplas visualizações de segmentos de vaso em imagens 2D. Aqui, os resultados da coloração por imunofluorescência para ER alfa são mostrados em verde e a contra-coloração com DPI.Em azul, em um anel de artéria peel isolado do cérebro de uma rata, as imagens sobrepostas sugerem a presença de receptor de estrogênio alfa intranuclear. Ao utilizar uma combinação de imagens Zack, pode-se obter uma imagem nítida da imunofluorescência do ER alfa, levando em consideração controles negativos de autofluorescência; ambos os controles para o anticorpo primário e secundário devem ser realizados. Observe a autofluorescência distinta ao longo do lado endotelial de uma artéria que não foi incubada com o anticorpo secundário.Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como isolar e destacar artérias da superfície do cérebro e preparar anéis transversais de oito mícrons. Além disso, você deverá estar familiarizado com o receptor de estrogênio alfa marcado com fluorescência e com a visualização dos receptores utilizando um microscópio digital de imunofluorescência e o software Nikon NIS-Elements.

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Biologia

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A autorradiografia do receptor Protocolo para a visualização localizada da angiotensina II Receptores

Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a coloração da imunofluorescência para observar diretamente as pilhas endothelial da aorta do rato. Esta técnica é útil ao estudar o phenotype celular e molecular de pilhas endothelial em testes padrões de fluxo diferentes e no desenvolvimento da aterosclerose.

Usando a mancha da imunofluorescência da cara do en para observar diretamente pilhas endothelial vasculares

O protocolo apresenta um modelo completo de murina induzida por TNBS da doença de Crohn e métodos para visualização de receptores de estrogênio por imunohistoquímica usando imunofluorescência de seções de cólon fixas de formalina embutidas em parafina.

Visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Mantendo o microscópio óptico limpa é importante para a alta qualidade de imagem. Poeira, impressões digitais, óleo de imersão em excesso, ou em meio de montagem ou em um microscópio provoca redução no contraste e resolução. DIC é especialmente sensível à contaminação e arranhões na superfície da lente. Este protocolo detalha o procedimento para manter o microscópio limpa.

Cuidados e limpeza do microscópio

Aprenda a otimizar a detecção imunofluorescente do receptor de estrogênio-α em artérias piais de ratas usando microscopia digital. Este método confiável permite visualizar ERα intranuclear em tecidos vasculares cerebrais.

Imagem de receptor de estrogênio α-in Rat Arteríolas Pial usando um Microscópio Digital imunofluorescência

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