JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:39 min • June 17th, 2025
Pegue uma lamínula com neurônios primários geneticamente modificados em uma câmara de imagem cheia de um tampão de imagem.
Essas células expressam um indicador redox baseado em proteína fluorescente na matriz mitocondrial.
Posicione a câmara sob um microscópio de fluorescência, identifique as células sob luz visível e mude para a imagem de fluorescência.
Aplique dois comprimentos de onda de excitação para estimular o indicador e medir a emissão de fluorescência.
A razão de intensidade de fluorescência nesses comprimentos de onda reflete o estado de oxidação mitocondrial.
Introduza NMDA para ativar os receptores NMDA celulares, causando influxo intracelular de cálcio.
O aumento desencadeia a captação de cálcio mitocondrial, induzindo a produção de ROS e
a oxidação
mitocondrial.O ROS oxida o indicador, alterando sua fluorescência e aumentando a relação do sinal.
Introduza agentes oxidantes para oxidar totalmente o indicador, maximizando a relação do sinal.
Remova o tampão e, em seguida, introduza agentes redutores para reduzir completamente o corante, minimizando a proporção do sinal.
Use as proporções de sinal máximo e mínimo para calibrar e quantificar a oxidação mitocondrial induzida por NMDA.
Para imagens ao vivo, defina o intervalo de lapso de tempo para 30 segundos e a duração para 25 minutos. Em seguida, monte as células, coloque a câmara no microscópio e focalize as células conforme demonstrado anteriormente. Mude para o modo de varredura e use o canal de 488 nanômetros na visualização ao vivo para focar e localizar as células para geração de imagens. Opcionalmente, para aumentar o número de células registradas por execução, use a função multiponto para criar imagens de dois a três campos de exibição por lamínula.
Inicie a aquisição de lapso de tempo e registre cinco imagens como uma gravação de linha de base de dois minutos. Adicione 500 microlitros de solução NMDA três vezes maior à câmara para atingir a concentração final de 30 micromolares e registre 20 imagens adicionais como uma resposta NMDA de 10 minutos. Em seguida, adicione 500 microlitros de quatro vezes a solução de DA à câmara e registre mais seis imagens. Aspire o tampão da câmara de imagem e substitua-o por 1 mililitro de solução de TDT. Depois de gravar mais 10 imagens, encerre a gravação e salve a série de imagens.