JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:53 min • August 7th, 2025
Pegue um filhote de rato anestesiado com perda auditiva geneticamente induzida.
Nessa condição, as células ciliadas do ouvido interno carecem de transportadores de glutamato, impedindo que o glutamato seja empacotado em vesículas e liberado.
Isso interrompe a transmissão de sinais sonoros para o nervo auditivo.
Raspe o mouse atrás da orelha esquerda, desinfete e aplique pomada para os olhos.
Estenda o pescoço e faça uma incisão.
Retraia o tecido adiposo e os músculos para expor o osso temporal.
Perfure a bula timpânica, parte do osso temporal, e alargue a abertura para expor a membrana da janela redonda ou RWM, uma barreira fina para o ouvido interno.
Perfure o RWM e injete o vetor viral adeno-associado que carrega o gene terapêutico.
As partículas virais se difundem e entram nas células ciliadas.
Dentro das células ciliadas, as partículas virais entregam seu material genético ao núcleo, desencadeando a produção do transportador de glutamato.
Isso permite o empacotamento e liberação do glutamato, restaurando a sinalização sonora do nervo auditivo.
Após confirmar a anestesia por pinça do dedo do pé, raspe a região pós-auricular esquerda e desinfete a pele de um camundongo pós-natal do 10º ao 12º dia com etanol a 70% e iodopovidona. Em seguida, cubra os olhos com uma pomada oftálmica protetora e posicione o animal com o pescoço estendido em uma almofada de aquecimento. Quando o preparo cirúrgico estiver completo, faça uma incisão no tecido subcutâneo com uma pequena tesoura para expor o músculo pós-auricular. Após retrair o tecido adiposo para o lado posterior da incisão, separe os músculos para os lados direito e esquerdo, perpendiculares à incisão.
Para expor o osso temporal. Use uma agulha de calibre 25 para perfurar a bula timpânica. Descascar o osso com uma pinça conforme necessário para expandir o orifício e permitir o acesso ao giro basal da cóclea.
Em seguida, alargue o orifício o suficiente para permitir a visualização da artéria estapedial e da membrana da janela redonda. Perfure suavemente a membrana redonda da janela no centro com uma pipeta capilar de borossilicato. Seque a membrana redonda da janela com um papel de filtro estéril. Em seguida, espere de cinco a dez minutos para que o efluxo de fluido se estabilize.
Nesta etapa, tome cuidado ao segurar e avançar a pipeta, para tornar a perfuração da membrana da janela redonda o menor possível. Dependendo do uso do microscópio, a pipeta pode ser segurada manualmente ou por micromanipulador. Como você pode ver aqui, seguramos a pipeta com a mão, pois o microscópio está muito próximo do mouse para permitir um micromanipulador.
Agora, coloque de um a dois microlitros do vírus em uma pipeta de vidro puxada com uma ponta de 15 micrômetros de diâmetro e microinjete o vírus na escala do tímpano através do mesmo orifício feito anteriormente na membrana da janela redonda.