JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:58 min • August 7th, 2025
Pegue um rato anestesiado com vértebras expostas, com os processos espinhosos e lâminas excisados dos níveis torácicos T7 a T9.
Corte as raízes dorsal e ventral acima e abaixo de T8.
Aplique solução salina para ajudar a parar o sangramento e remova o líquido usando uma esponja.
Passe a medula espinhal entre T8 e T9 para cortar as fibras nervosas.
Coloque espuma comprimida na abertura e aplique solução salina.
Assim que o sangramento parar, remova a espuma e limpe o fluido residual.
Deslize um conduíte de polímero piezoelétrico pré-preparado, com as janelas abertas, sobre o coto da medula espinhal rostral.
Insira o coto caudal na extremidade oposta do conduíte.
Injete as células de Schwann, suspensas em uma matriz injetável, através das janelas do conduíte.
Feche as janelas com segurança.
As células de Schwann povoam o conduto e secretam fatores neurotróficos que sustentam o crescimento do axônio.
O conduíte fornece orientação estrutural, enquanto suas propriedades piezoelétricas geram pistas bioelétricas para o crescimento de neuritos.
Gradualmente, os axônios se regeneram através da ponte, restaurando a continuidade entre os tocos.
Quando todas as lâminas tiverem sido removidas, confirme se as lacunas entre os processos transversos são visíveis, especialmente em T8, e examine os ossos ao longo de ambos os lados entre T7 e T9 para confirmar que não há fragmentos ósseos salientes para fora e as raízes dorsais devem se tornar visíveis. Usando uma tesoura de mola angular, corte as raízes dorsal e ventral acima e abaixo de T8. E adicione solução salina à medula espinhal para ajudar a parar o sangramento.
Em seguida, coloque a tesoura de mola angular acima da medula espinhal nos espaços entre os processos transversos em T8 e faça um corte para cortar completamente o tecido nervoso. Coloque um pequeno pedaço de espuma comprimida na lacuna resultante de 2 a 2,5 milímetros e adicione imediatamente solução salina à área.
Enquanto espera que os cotos de cordão cortados atinjam a hemostasia, corte os triângulos de absorção em pedaços finos e longos e remova um conduíte do armazenamento de PBS. Coloque alguns triângulos no conduíte para remover o excesso de PBS e confirme se as janelas pré-cortadas estão abertas.
Em seguida, remova o meio de um pellet de célula GFP Schwann e ressuspenda as células de Schwann em 10 microlitros de DMEM / F-12 frio. Adicione 10 microlitros de gel injetável frio à suspensão celular e misture bem com pipetagem repetida. Em seguida, coloque a suspensão celular no gelo. Quando os cotos do cordão estiverem prontos, remova a espuma comprimida e, em seguida, use pedaços longos dos triângulos de absorção para remover a solução salina e o sangue da área de laminectomia.
Em seguida, use uma micro espátula para levantar suavemente o coto rostral e deslize o conduíte sobre o toco com as janelas voltadas para cima. Tomando cuidado para que todo o coto seja inserido e que não haja sangramento excessivo no conduíte. Levante suavemente o coto caudal e deslize a outra extremidade do conduíte sobre ele. Tomando cuidado para que todo o coto seja inserido e que as janelas fiquem na superfície dorsal.
Em seguida, use uma micropipeta equipada com uma ponta de carregamento de Western blot para injetar 20 microlitros da mistura de matriz injetável de células GFP Schwann no conduíte através de uma das janelas pré-cortadas. E feche as janelas.