Espectroscopia Raman anti-Stokes coerente para visualizar neurônios mielinizados no tecido cerebral de camundongos

Pegue uma fatia de cérebro de camundongo quimicamente fixada em uma placa multipoços.

O tecido contém axônios cercados por bainhas de mielina ricas em lipídios. Os corpos celulares contêm corpos de Nissl compostos de retículo endoplasmático rugoso e ribossomos.

Incubar em uma solução de permeabilização contendo uma coloração fluorescente de Nissl. A solução permeabiliza as membranas celulares, permitindo que a coloração se ligue ao RNA ribossômico dentro dos corpos de Nissl e marque os corpos celulares.

Coloque o tecido sob um microscópio confocal com um sistema de imagem coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes, ou CARS.

Bomba sincronizada direta e feixes de laser Stokes no tecido, ajustados para excitar ligações moleculares na bainha de mielina rica em lipídios.

Introduza um feixe de laser de sonda para interagir com as ligações excitadas e produzir um sinal anti-Stokes específico para a mielina.

Um fotodetector captura o sinal para gerar uma imagem específica da mielina.

Use imagens confocais para capturar sinais dos corpos Nissl rotulados.

Sobreponha as imagens confocal e CARS para visualizar a arquitetura neuronal.

Depois de preparar os tecidos conforme descrito no manuscrito, core as seções flutuantes para Nissl e meios de anticorpos para visualizar os corpos celulares. Em seguida, incube as seções em um agitador de laboratório padrão por 30 minutos em temperatura ambiente. Antes de levar as amostras ao microscópio, ligue e aqueça o laser CARS por pelo menos uma hora. Em seguida, alinhe o laser CARS sobrepondo espacialmente a bomba e os feixes de laser Stokes e ajuste o atraso entre os dois feixes de laser.

Kohler a óptica do condensador e o diafragma do microscópio para imagens CARS diretas. Em seguida, ajuste o periscópio externo para centralizar os dois lasers espacialmente sobrepostos nos espelhos da cabeça de varredura do microscópio. Para melhor detecção de CARS não digitalizados, certifique-se de que o condensador esteja conectado.

Para imagens confocais de imunofluorescência e imagens CARS, ajuste o laser CARS com detectores diretos e epi-CARS não digitalizados, incorporando um microscópio confocal equipado com lasers visíveis para imagens de fluorescência. Agora, coloque as seções em uma placa de cultura com fundo de lamínula e PBS para evitar o ressecamento do tecido. Além disso, use um peso de vidro para manter o lenço perto da lamínula.

Usando a interface gráfica do usuário. Defina os parâmetros de aquisição de imagem para imagens confocais de fluorescência CARS e Nissl. Coloque a amostra no microscópio stage. Focalize a amostra e capture as imagens.