Visualizando Proteínas e Complexos Macromoleculares por Negative EM Stain: Preparação de Grid para Aquisição de Imagem

O objetivo geral deste procedimento é visualizar amostras de proteínas purificadas por microscopia eletrônica de contraste negativo. Isso é realizado primeiramente preparando as grades de microscopia eletrônica que suportarão a amostra. O segundo passo do procedimento é preparar a solução de contraste negativo.

Em seguida, a amostra é aplicada na grade de microscopia eletrônica e contrastada negativamente. Por fim, a grade de ME é inserida em um microscópio eletrônico e as imagens são registradas sob condições ópticas apropriadas. As imagens convencionais de campo claro e de DEM apresentam alto contraste e detalhes nítidos, mostrando macromoléculas individuais espalhadas sobre um fundo sem características.

A microscopia eletrônica com contraste negativo é um método simples para visualizar sua proteína de interesse. Pode ser usada como um ensaio rotineiro para examinar sua proteína purificada, seja para análise estrutural ou outros ensaios bioquímicos e biofísicos. Aqui demonstramos como preparar uma amostra com contraste negativo para microscopia eletrônica.

A demonstração visual deste método é útil, pois alguns dos passos são difíceis de aprender apenas por meio de descrições textuais e figuras. Comece usando uma pipeta de vidro para colocar uma única gota de colódio em um grande béquer com água, sobre a superfície da água. À medida que o colódio se espalha, ele pode capturar poeira da superfície da água.

Remova e substitua uma película empoeirada de plástico de colódio por outra gota. Em seguida, coloque entre 50 e 100 grades de ME, uma a uma, sobre a película plástica flutuante, com o lado brilhante voltado para baixo. Selecione grades de 400 malhas para coloração negativa de rotina e selecione grades de 200 malhas.

Para coletar imagens em pares inclinados. Selecione um pedaço de papel com baixa absorção e sem rugas, ligeiramente maior que a área das grades. Coloque o papel sobre as grades e aguarde até que o papel fique completamente úmido.

O papel não deve absorver a água muito rapidamente. Utilizamos papel de um bloco de anotações barato. As grades estão agora entre a película plástica e o papel.

Use um par de pinças para colocar o papel em uma placa de Petri para secar lentamente ao ar. Evite métodos de secagem mais rápidos, pois podem causar rugas. A máquina de revestimento com carbono utilizada em nosso laboratório é uma Creston 2 0 8 C high vacuum turbo carbon coer.

Equipado com um monitor de espessura de filme Creston. O monitor utiliza um balanço de quartzo sensível a depósitos de carbono. No entanto, o protocolo descrito aqui não exige este dispositivo. Comece afiando e carregando as hastes de carbono em uma máquina de revestimento a carbono.

Em seguida, recubra um lâmina de vidro com graxa de vácuo, deixando metade da área fosca sem recobrimento. Após o revestimento com carbono, as regiões engraxadas da lâmina são usadas para estimar a espessura do revestimento de carbono. Coloque o papel com as grades sobre a platina sob o recipiente de vidro da máquina de revestimento com carbono. Posicione a lâmina engraxada.

Deslize próximo às grades. Bombeie a câmara de vácuo até pelo menos 10 microtorr; caso contrário, faíscas gerarão muitas partículas grandes na grade. Agora, aumente a corrente muito lentamente.

A ponta afiada da haste de carbono ficará extremamente brilhante. Não a observe a olho nu enquanto o revestimento começa; a lâmina de vidro mudará de cor para um cinza escuro à medida que a camada de carbono se acumula. Interrompa a corrente na espessura desejada de carbono e leve em consideração a transparência do recipiente de vidro. Ao fazer essa avaliação, uma vez que a escuridão da lâmina seja calibrada em relação à espessura do carbono, este método é tão preciso quanto o monitor de espessura de filme, mais caro.

Quando o processo estiver concluído, libere a câmara de vácuo e remova as grades revestidas para uso posterior. A camada fina de plástico não afetará a qualidade da imagem corada negativamente, mas pode ser removida mergulhando as grades em clorofórmio por várias horas antes de prosseguir. Prepare uma solução fresca de formiato de uranila ou use uma solução que tenha sido armazenada no escuro por menos de duas semanas.

Uma boa solução fresca apresenta cor amarela, pH em torno de quatro e apresenta corrida muito limpa, sem precipitados. Comece utilizando um sistema comercialmente disponível para gerar brilho. Descarregue as grades revestidas com carbono.

Em seguida, coloque duas gotas de 20 microlitros de água destilada e duas gotas de 25 microlitros de solução fresca de formiato urinário sobre um pedaço de perfil. Usando pinças de capilaridade reversa com força antigravitacional, segure uma grade previamente submetida à descarga luminosa, com o lado revestido de carbono voltado para cima. Criticamente, essas pinças não sugam o líquido das grades.

Aplique agora dois microlitros da amostra proteica à grade e aguarde enquanto as proteínas são absorvidas pela grade. Isso geralmente leva 30 segundos, mas amostras muito diluídas exigirão mais tempo, o que pode afetar as concentrações do tampão. Ao finalizar, remova a amostra proteica com papel filtro.

Em seguida, lave a grade duas vezes tocando brevemente sua superfície em uma gota de água e secando-a com papel absorvente em alguns segundos. Após a água tocar brevemente a grade, leve-a a uma gota de corante e seque-a rapidamente. Usando a mesma técnica, deixe a grade em contato com uma segunda gota de corante por 20 segundos.

Por fim, seque a grade ao ar na capela de bancada ou, preferencialmente, em vácuo antes da sessão de microscopia eletrônica; verifique o alinhamento do microscópio de microscopia eletrônica carregando um arquivo de alinhamento aperfeiçoado, se disponível, o que deve restaurá-lo a um estado próximo do perfeito. Agora, carregue a grade de ME em um suporte padrão de amostra com inclinação simples. Em seguida, insira o suporte na platina.

Em seguida, aguarde a conclusão do ciclo de bombeamento e insira o suporte na coluna. Agora, inicie a busca por uma área da amostra com boa coloração. Foque manualmente utilizando o método de contraste mínimo ou com uma câmera CCD e calcule o foco em tempo real.

Seu espectro de potência. Em seguida, ajuste o foco profundo conforme necessário, geralmente para menos 1,5 mícrons. A concentração da coloração pode variar ao longo da grade, portanto, procure proteínas com contraste branco.

Evite áreas com coloração irregular ou coloração positiva onde o contraste da proteína se torna preto. Utilizando a abordagem descrita para a confecção de grades e visualização de amostras coradas negativamente, várias proteínas conhecidas foram imagiadas para fins demonstrativos.

Observe os detalhes e o alto contraste. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar amostras de macromoléculas coradas negativamente para observação em um microscópio eletrônico. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de quatro horas.

Após este procedimento, outros métodos como reconstrução 3D podem ser realizados para compreender melhor as estruturas moleculares.