Visualizando Proteínas e Complexos Macromoleculares por Negative EM Stain: Preparação de Grid para Aquisição de Imagem

O objetivo geral deste procedimento é visualizar amostras de proteínas purificadas por microscopia eletrônica de coloração negativa. Isso é feito preparando primeiro as grades de microscopia eletrônica que suportarão a amostra. A segunda etapa do procedimento é preparar a solução de corante negativo.

Em seguida, a amostra é aplicada na grade de microscopia eletrônica e corada negativamente. Por fim, a grade EM é carregada em um microscópio eletrônico e as imagens são registradas sob condições ópticas apropriadas. As imagens DEM convencionais de campo claro são de alto contraste e nitidamente detalhadas, mostrando uma única macromolécula espalhada sobre um fundo sem características.

A microscopia eletrônica de coloração negativa é um método simples de visualizar sua proteína favorita. Ele pode ser usado como um ensaio de rotina para examinar sua proteína purificada, seja para análise estrutural ou outros ensaios bioquímicos e biofísicos. Aqui demonstramos como preparar uma amostra corada negativamente para microscopia eletrônica.

A demonstração visual desse método é útil, pois algumas das etapas são difíceis de aprender com descrições de texto e figuras. Comece usando uma pipeta de vidro para colocar uma única gota de colódio em um copo grande de água na superfície da água. À medida que o colódio se espalha, ele pode capturar poeira da superfície da água.

Remova e substitua uma película empoeirada de plástico de colódio por outra gota. Em seguida, coloque entre 50 e 100 grades EM, uma a uma, no filme plástico flutuante, com o lado brilhante voltado para baixo. Selecione 400 grades de malha para coloração negativa de rotina e selecione 200 grades de malha.

Para coletar imagens de pares de inclinação. Selecione um pedaço de papel sem rugas de absorção lenta que seja ligeiramente maior que a área das grades. Coloque o papel em cima das grades e espere até que o papel fique completamente molhado.

O papel não deve absorver água muito rapidamente. Usamos papel de um bloco de notas barato. As grades agora estão imprensadas entre o filme plástico e o papel.

Use uma pinça para colocar o papel em uma placa de Petri para secar lentamente. Evite métodos de secagem mais rápidos, pois podem causar rugas. A máquina de revestimento de carbono usada em nosso laboratório é uma coer de carbono turbo de alto vácuo Creston 2 0 8 C.

Equipado com um monitor de espessura de filme Creston. O monitor utiliza uma balança de quartzo sensível a depósitos de carbono. No entanto, o protocolo descrito aqui não requer este dispositivo Comece afiando e carregando as hastes de carbono em uma máquina de revestimento de carbono.

Em seguida, uma lâmina de vidro com graxa a vácuo deixando metade da área fosca sem revestimento Após o revestimento de carbono, as regiões lubrificadas da lâmina são usadas para estimar a espessura da camada de carbono. Coloque o papel com grades no palco sob a redoma da máquina de revestimento de carbono. Posicione o vidro lubrificado.

Deslize ao lado das grades. Bombeie a câmara de vácuo até pelo menos 10 micro voltas, caso contrário, a faísca gerará muitas partículas grandes na grade. Agora aumente a corrente muito lentamente.

A ponta afiada da haste de carbono ficará extremamente brilhante. Não observe a olho nu quando o revestimento começar, a lâmina de vidro mudará de cor para cinza escuro à medida que o revestimento de carbono se acumula, corte a corrente na espessura de carbono desejada e leve em consideração a transparência da redoma de vidro. Ao fazer esse julgamento, uma vez que a escuridão da lâmina é calibrada para a espessura do carbono, esse método é tão preciso quanto o monitor de espessura de filme mais caro.

Quando o processo estiver concluído, ventile a câmara de vácuo e remova as grades revestidas para uso posterior. A fina camada de plástico não afetará a qualidade da imagem manchada negativamente, mas pode ser removida embebendo as grades em clorofórmio por várias horas Antes de prosseguir. Faça uma solução de formato de L de urina fresca ou use uma solução que tenha sido armazenada no escuro por menos de duas semanas.

Uma boa solução fresca tem uma cor amarela, um pH de cerca de quatro e funciona muito limpa, sem precipitados. Comece usando um sistema disponível comercialmente para brilhar. Descarregue as grades revestidas de carbono.

Em seguida, coloque duas gotas de 20 microlitros de água destilada e 2 gotas de 25 microlitros de solução fresca de formato de mictório em um pedaço de perfil. Usando uma pinça anticapilar de força reversa, segure uma grade descarregada de brilho, com o lado revestido de carbono para cima. Criticamente, essas pinças não sugam o líquido das grades.

Agora aplique dois microlitros de amostra de proteína na grade e espere enquanto as proteínas são absorvidas pela grade. Isso normalmente leva 30 segundos, mas amostras muito diluídas exigirão mais tempo, o que pode afetar as concentrações de tampão. Quando terminar, seque a amostra de proteína usando papel de filtro.

Em seguida, lave a grade duas vezes, tocando brevemente sua superfície em uma gota de água e secando-a em alguns segundos. Depois que a água tocou brevemente a grade para uma gota de mancha e rapidamente secá-lo. Usando a mesma técnica, deixe a grade entrar em contato com uma segunda gota de mancha por 20 segundos.

Finalmente, seque ao ar a grade na hotte da bancada ou, de preferência, no vácuo antes da sessão EM, verifique o alinhamento do microscópio EM carregando um alinhamento aperfeiçoado file se disponível, deve restaurá-lo a condições quase perfeitas. Agora carregue a grade EM em um suporte de amostra padrão de inclinação única. Em seguida, insira o suporte no palco.

Em seguida, aguarde a conclusão do ciclo de bombeamento e insira o suporte na coluna. Agora comece a procurar uma área de amostra com boa mancha. Foque manualmente usando o método de contraste mínimo ou usando uma câmera CC, D e calculando os quatro ao vivo.

Seu espectro de potência. Em seguida, defina o foco profundo conforme necessário, geralmente para 1,5 mícron negativo. A concentração de manchas pode variar em toda a grade, portanto, procure proteínas com contraste branco.

Evite áreas com manchas irregulares ou positivas onde o contraste de proteínas se torne preto. Usando a abordagem delineada para fazer grades e visualizar amostras com coloração negativa. Várias proteínas familiares foram fotografadas para fins de demonstração.

Observe seus detalhes e contraste nítido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar amostras de macromoléculas coradas negativamente para observação em um microscópio eletrônico. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cerca de quatro horas.

Após este procedimento, outros métodos como a reconstrução 3D podem ser realizados para entender melhor as estruturas moleculares.