Imagem da dinâmica do cálcio em células ciliadas da linha lateral de larvas de peixe-zebra

Pegue uma larva de peixe-zebra transgênica paralisada montada em uma câmara de perfusão.

A larva expressa indicadores de cálcio localizados na membrana nas células ciliadas do neuromast, um componente do sistema da linha lateral que detecta o movimento da água.

As células ciliadas compreendem feixes capilares apicais e regiões pré-sinápticas basais, que formam sinapses com neurônios aferentes para transmitir sinais.

Sob um microscópio confocal, use baixa ampliação para posicionar uma pipeta de jato de fluido perto da larva.

Aumente a ampliação para localizar um neuromast, reposicione a pipeta perto dele e mude para a

imagem de fluorescência.

Fornece pulsos de fluido para desviar os feixes de cabelo, abrindo canais de mecanotransdução para o influxo de cátions apicais, incluindo íons de cálcio.

Indicadores fracamente fluorescentes se ligam ao cálcio, causando um aumento localizado na fluorescência.

O influxo de cátions despolariza a célula, desencadeando a entrada de cálcio através de canais dependentes de voltagem na pré-sinapse basal, onde se liga aos indicadores e aumenta a fluorescência localmente.

Visualize a dinâmica apical e basal do cálcio em tempo real.

Neste procedimento, preencha 10 microlitros de tampão neuronal em uma agulha de jato de fluido devidamente quebrada usando uma ponta de carregamento de gel. Carregue a solução uniformemente até a ponta sem bolhas. Em seguida, insira a agulha no porta-pipetas acoplado ao micromanipulador motorizado.

Coloque a câmara de perfusão em um adaptador de câmara circular no microscópio stage. Mova o estágio motorizado para que a larva fique no centro do campo de visão. Em seguida, gire o adaptador de câmara circular de modo que o eixo AP da larva fique aproximadamente alinhado com a trajetória da agulha do jato de fluido.

Usando luz transmitida e contraste de interferência diferencial, coloque a larva em foco e centralize-a sob a objetiva de 10x. Em seguida, aumente o objetivo de 10x. Usando o micromanipulador motorizado, traga a agulha do jato de fluido para o centro do campo de visão, para que seja iluminada pela luz transmitida e mal toque o tampão neuronal.

Abaixe a objetiva de 10x para focar na larva para confirmar sua localização. Concentre o objetivo na agulha do jato de fluido. Mova a agulha de jato de fluido com o micromanipulador nos eixos x e y até que esteja posicionada paralelamente ao lado dorsal da larva.

Depois, concentre-se novamente na larva. Abaixe a agulha no eixo z e posicione a agulha ao longo do lado dorsal do peixe, a 1 milímetro de distância do corpo. Mova cuidadosamente o adaptador de câmara circular para garantir que a agulha do jato de fluido esteja alinhada ao longo da linha média AP da larva.

Em seguida, mude para o objetivo de água 60x. Certifique-se de que o objetivo esteja imerso no tampão neuronal. Use o foco fino para localizar um neuromast. Em seguida, mova o estágio motorizado para colocar o neuromastro de interesse no centro do campo de visão.

Mantenha a ponta da agulha do jato de fluido ao longo do lado dorsal do peixe. Não toque a ponta da agulha do jato de fluido na larva ou na superfície da câmara. Posicione a agulha de jato de fluido com o micromanipulador de forma que fique a 100 micrômetros da borda externa do neuromast.

Em seguida, concentre-se nas pontas dos feixes de cabelo apicais. A parte inferior da agulha do jato de fluido deve estar em foco neste plano. Defina a pinça de pressão de alta velocidade do modo manual para o modo externo para receber entrada do software de imagem. Zere a pressão de alta velocidade clamp pressionando o botão zero e use o botão de ponto de ajuste para definir a pressão de repouso ligeiramente positiva. Confirme a saída de repouso do clamp de pressão de alta velocidade usando um manômetro PSI conectado ao cabeçote stage saída.

Para determinar a pressão necessária para estimular os feixes de cabelo, aplique um estímulo de teste com uma saída de 0,125 e 0,25 volts por 200 a 500 milissegundos. Para cada estímulo de teste, meça a distância de deflexão das pontas dos feixes de cabelo (os cinocílios). Escolha uma pressão que mova os feixes a uma distância de aproximadamente 5 micrômetros. Certifique-se de que as pontas dos cinocílios permaneçam em foco o tempo todo.

Para adquirir imagens de plano único, selecione um estímulo a ser fornecido durante a aquisição de 80 quadros após o quadro 30 em três segundos. Para medir as respostas mecanosensíveis do cálcio, concentre-se na base dos feixes capilares apicais e inicie a aquisição da imagem. Para medir as respostas pré-sinápticas de cálcio, concentre-se na base das células ciliadas e inicie a aquisição da imagem.