Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:07 min. • June 17th, 2025
Comece com fibras musculares murinas quimicamente fixadas e permeabilizadas colocadas nos poços de uma placa multipoços.
Incubar em uma solução de bloqueio para minimizar a ligação de anticorpos não específicos.
Adicione anticorpos primários direcionados a uma proteína pré-sináptica expressa na junção neuromuscular ou NMJ.
Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.
Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo direcionados aos anticorpos primários e uma neurotoxina conjugada com fluoróforo que se liga aos receptores de acetilcolina pós-sinápticos.
Lave com tampão para remover os reagentes não ligados.
Coloque as fibras em uma lâmina com mídia de montagem, posicione uma lamínula e prenda com ímãs cilíndricos para achatar as fibras.
Comece a imagem usando um microscópio confocal STED.
Após a iluminação do laser, as proteínas marcadas fluorescem.
A microscopia confocal não consegue resolver estruturas NMJ mais finas com clareza devido à sua resolução limitada e propagação de fluorescência.
Em contraste, a microscopia STED usa um laser de depleção para suprimir a propagação da fluorescência, permitindo uma visualização clara da JNM.
Após a eutanásia, comece a provocar os
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