Caracterização de junções neuromusculares em camundongos por microscopia combinada confocal e super-resolução

Comece com fibras musculares murinas quimicamente fixadas e permeabilizadas colocadas nos poços de uma placa multipoços.

Incubar em uma solução de bloqueio para minimizar a ligação de anticorpos não específicos.

Adicione anticorpos primários direcionados a uma proteína pré-sináptica expressa na junção neuromuscular ou NMJ.

Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.

Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo direcionados aos anticorpos primários e uma neurotoxina conjugada com fluoróforo que se liga aos receptores de acetilcolina pós-sinápticos.

Lave com tampão para remover os reagentes não ligados.

Coloque as fibras em uma lâmina com mídia de montagem, posicione uma lamínula e prenda com ímãs cilíndricos para achatar as fibras.

Comece a imagem usando um microscópio confocal STED.

Após a iluminação do laser, as proteínas marcadas fluorescem.

A microscopia confocal não consegue resolver estruturas NMJ mais finas com clareza devido à sua resolução limitada e propagação de fluorescência.

Em contraste, a microscopia STED usa um laser de depleção para suprimir a propagação da fluorescência, permitindo uma visualização clara da JNM.

Após a eutanásia, comece a provocar os músculos tibiais anteriores em pequenos feixes de fibras de cerca de 1 milímetro de largura usando duas pinças serrilhadas finas. Em seguida, transfira esses feixes musculares para uma placa de 24 poços contendo 1% de Triton X-100 preparado em PBS e deixe-o agitar suavemente por uma hora em temperatura ambiente ou cinco horas a 4 graus Celsius.

Depois de lavar as amostras três vezes por 5 minutos com PBS à temperatura ambiente, incubar as amostras com uma solução de bloqueio composta de 4% de BSA preparada em PBS com 1% de Triton X-100 por quatro horas a 4 graus Celsius sob agitação suave. Em seguida, incube as amostras durante a noite com a mesma solução de bloqueio contendo anticorpos monoclonais primários contra o neurofilamento M ou a glicoproteína 2 da vesícula sináptica para rotular os terminais do axônio pré-sináptico ou as zonas ativas, respectivamente.

No dia seguinte, lave os feixes musculares rotulados três vezes por 5 minutos com PBS sob agitação suave. Em seguida, incube-os com anticorpos secundários apropriados, colocando-os em um agitador por duas horas em temperatura ambiente. Depois de lavar novamente os feixes musculares, coloque-os em uma lâmina com meio de montagem. Em seguida, coloque uma lamínula de vidro de 1,5 grau na parte superior, seguida por ímãs cilíndricos em ambos os lados da lâmina para aplicar pressão e achatar os músculos.

Para adquirir imagens usando o microscópio confocal, inicie o software do microscópio e escolha Máquina como modo de configuração e colete pilhas de imagens das junções neuromusculares em cada grupo experimental de acordo com as configurações mencionadas no manuscrito do texto. Ao final da sessão, clique em Abrir no Visualizador 3D e escolha uma junção neuromuscular representativa de um grupo experimental para visualizar a rotulagem 3D.