Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

O objetivo geral do experimento a seguir é derivar a progênie neuronal direta e exclusivamente de células-tronco embrionárias humanas pluripotentes usando indução de pequenas moléculas. Isso é obtido adicionando ácido rettino a células indiferenciadas mantidas sob condições definidas. Em seguida, o processo de diferenciação é continuado destacando as células em uma cultura de suspensão, onde formam aglomerados celulares flutuantes chamados neuroblastos.

Se os neuroblastos puderem se ligar a uma placa de cultura de tecidos em meios de neurodiferenciação, eles desenvolvem características de neurônios maduros. Em última análise, imunofluorescência e deconvolução ou microscopia confocal podem ser usadas para mostrar o efeito do tratamento com ácido rettino na morfologia e expressão de marcadores de células-tronco embrionárias humanas tratadas. Em outras técnicas, apenas uma pequena fração de células busca um fenótipo neuronal, enquanto nosso método permite a indução eficiente e bem controlada de células-tronco embrionárias humanas pluripotentes exclusivamente para uma linhagem neuronal pelo simples fornecimento de pequenas moléculas.

Existem algumas etapas a serem observadas ao reparar soluções de estoque. Tome cuidado para descongelar lentamente o matrigel e a laminina humana de menos 80 graus Celsius a quatro graus Celsius durante a noite, armazene a mídia a quatro graus Celsius e sempre aqueça a mídia a 37 graus Celsius antes de usar. Além disso, ao preparar o meio ESL humano, alguns dos suplementos são adicionados antes de serem usados.

Estes incluem BFGF, ácido ascórbico, insulina humana ativa em A e transferência. Em seguida, faça o gel matra ou as soluções de trabalho de laminina humana imediatamente antes do revestimento da placa. Incube as placas a 37 graus SIUs em 5% de dióxido de carbono Depois que as placas de cultura de tecidos pré-revestidas com gelatina forem preparadas.

A gelatina pode ser substituída pela solução de trabalho matrigel ou laminina. Cubra essas placas incubando-as durante a noite a quatro graus Celsius. Comece permitindo que as colônias de células ES humanas cresçam por cinco a sete dias e depois prepare-se para se dividir.

Alguns deles selecionam colônias com mais de 75%Sob células ES humanas diferenciadas, geralmente são ligeiramente opacas com bordas definidas colônias contendo células empilhadas. Uma indicação do início da diferenciação geralmente parece ser colônias brancas contendo principalmente células diferenciadas geralmente parecem ser claras. Não selecione colônias brancas ou claras.

Segure as placas contra a luz e use um marcador para delinear as colônias ligeiramente opacas na parte inferior das placas ao longo dos contornos. Use a borda de uma ponta de pipeta P dois estéreis para separar a camada de fibroblastos circundante da colônia de células ES humanas. Em seguida, remova as células de fibroblastos circundantes e também remova todas as partes diferenciadas da colônia.

Agora aspire a mídia antiga contendo as células diferenciadas destacadas. Em seguida, em cada poço, lave as células indiferenciadas uma vez com meios de células E es humanas sem BFGF e, em seguida, adicione três mililitros de meio ESL humano fresco contendo B-F-G-F-B-F-G-F é adicionado ao meio fresco imediatamente antes do uso. Agora use uma ponta de pipeta P dois estéril para cortar as colônias em pedaços pequenos e separá-las da placa.

Puxe os pedaços de colônia destacados em sua mídia em um tubo cônico de 50 mililitros. Puxe um adicional. Enxágue com mídia mililitro por poço.

As células estão agora prontas para uma maior diferenciação usando pequenas moléculas. Comece aquecendo placas recém-revestidas a 37 graus Celsius. Aspire a solução de revestimento das placas e adicione uma alíquota de quatro mililitros de mídia contendo pedaços de colônia em cada poço e, em seguida, transfira suavemente as placas para uma incubadora sem agitá-las.

Não mexa nas placas para que possam semear. Após a semeadura por três dias, faça um novo meio contendo ácido ômico. Em seguida, remova a maior parte da mídia antiga, deixando apenas mídia suficiente para que as células permaneçam submersas.

As células nunca devem secar em cada uma. Bem: Adicione quatro mililitros de meio de células ES humanas frescas com BFGF e ácido rettino. Substitua o meio a cada dois dias e permita que as colônias de células ES humanas tratadas com ácido rettino cresçam.

Após sete ou oito dias, as células terão sofrido alterações morfológicas em grandes células diferenciadas. Em seguida, prossiga com a criação de uma cultura de células em suspensão para fazer uma cultura em suspensão começar separando as colônias de ESL das células que se diferenciaram espontaneamente e migraram para formar uma camada de fibroblastos. Use a técnica acima mencionada com uma ponta de pipeta estéril e, em seguida, aspire o meio antigo contendo células de fibroblastos destacadas flutuantes.

Lave as células uma vez com meio HESC e suspenda-as novamente em três mililitros de meio HESC. Agora usando uma ponta de pipeta P estéril duas. Corte as colônias em pedaços pequenos e separe-as do prato.

Puxe a mídia com colônias destacadas em um único tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue os poços com um mililitro de mídia e adicione o enxágue à piscina. Em seguida, alíquota de quatro mililitros das células agrupadas em cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa de seis poços por quatro a cinco dias, mantenha a placa em uma incubadora.

Durante esse período, aglomerados celulares flutuantes ou neuroblastos se formarão para avançar ainda mais o neuroblasto para um fenótipo neuronal mais maduro. Puxe a mídia que os contém para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue as células a 1.400 rpm por cinco minutos.

Aspire, pese o máximo possível da mídia antiga e adicione uma quantidade igual de mídia NSC nova contendo VEGF N NT três e BDNF. Misture as células em uma suspensão por pipetagem e, em seguida, alíquota de quatro mililitros da suspensão por poço em seis. As placas de cultura de tecidos de poço transferem as placas para uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius.

O neuroblasto se ligará às placas de cultura durante a noite para uma cultura 3D em Matrigel ou laminado humano na suspensão do neuroblasto. E uma matriz 3D polimerizará a 37 graus Celsius. Substitua a mídia a cada dois dias.

Dentro de duas semanas, extensas redes de células neuronais portadoras de neuritos e células pigmentadas parecerão que o ácido rettino se torna suficiente para induzir as células ES humanas mantidas no sistema de cultura definido a fazer a transição da pluripotência exclusivamente para um fenótipo neuroepidérmico. Após a exposição de células E es humanas indiferenciadas ao ácido retinóico, todas as células da colônia sofreram alterações morfológicas em grandes células diferenciadas que deixaram de expressar o marcador associado à pluripotência OCT quatro. As células também começaram a expressar vários marcadores associados ao neuroectoderma, como HNK um a, P dois e TRKC.

Essas grandes células diferenciadas continuaram a se multiplicar e as colônias aumentaram de tamanho, expressando espontaneamente o marcador neuronal inicial beta três tubulina. O mapa de marcadores neuronais mais maduros dois começou a aparecer em áreas das colônias onde as células se acumularam. Coincidentemente, com o aparecimento das células neuroectodérmicas, o fator de transcrição específico neuronal NER um implicado na diferenciação neuronal dopaminérgica e ativação do gene da tirosina hidroxilase translocada para o núcleo.

Após o descolamento, as células ES humanas tratadas com ácido rettino formaram neuroblastos em uma cultura de suspensão após a remoção do FGF básico e depois de permitir que o neuroblasto se ligasse a uma placa de cultura de tecidos, extensas redes de células neuronais portadoras de neuritos e células pigmentadas, típicas do SNC, começaram a aparecer com um aumento drástico na eficiência e puderam ser cultivadas ao longo de três meses. Essas células neuronais derivadas de células ES humanas expressaram beta três tubulina em comparação com a diferenciação espontânea de várias linhagens de células sem tratamentos com ácido rettino e mapa co-expresso dois Uma vez dominado. Esta técnica pode ser usada para gerar progenitores neuronais em células neuronais uniformemente a partir de células-tronco embrionárias humanas pluripotentes em cerca de quatro semanas, se for realizada corretamente.

Não se esqueça de que trabalhar com células humanas pode ser extremamente perigoso e precauções como garantir que as linhagens celulares estejam livres de patógenos e micoplasma devem sempre ser tomadas antes de realizar este procedimento.