Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

O objetivo geral do experimento a seguir é obter derivados cardíacos diretamente e exclusivamente a partir de células-tronco embrionárias humanas pluripotentes utilizando indução por moléculas pequenas. Isso é alcançado pela adição de nicotinamida a células ES humanas indiferenciadas mantidas em condições definidas. Em seguida, as células em diferenciação cardíaca são destacadas para formar cardioblastos, agregados celulares flutuantes em cultura de suspensão.

Uma vez formados, os cardio blasts são cultivados em meio de diferenciação cardíaca, onde continuam a se desenvolver em cardiomiócitos contráteis. Por fim, os resultados são avaliados por imunofluorescência com microscopia de desconvolução ou confocal e por gravações eletrofisiológicas. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a indução eficiente de células-tronco embrionárias humanas pluripotentes exclusivamente para a linhagem cardíaca mediante a simples adição de moléculas pequenas.

Enquanto nos métodos existentes de diferenciação multilinagem, apenas uma pequena fração das células adota um fenótipo cardíaco. Há algumas etapas que exigem cuidado ao preparar soluções estoque. Tenha o cuidado de descongelar lentamente a matrigel e a laminina humana de menos 80 graus Celsius para quatro graus Celsius durante a noite, armazene os meios a quatro graus Celsius e aqueça sempre os meios a 37 graus Celsius antes do uso.

Além disso, ao preparar o meio para células-tronco embrionárias humanas, alguns dos suplementos são adicionados imediatamente antes de seu uso. Estes incluem BFGF, ácido ascórbico, insulina humana ativa em A e transferina. Em seguida, prepare as soluções de trabalho de matrigel ou laminina humana imediatamente antes do revestimento das placas.

Incube as placas a 37 graus SIUs em 5% de dióxido de carbono após o preparo das placas de cultura tecidual pré-revestidas com gelatina. A gelatina pode ser substituída pelo gel matra ou pela solução de trabalho de laminina. Revesta essas placas incubando-as durante a noite a quatro graus Celsius.

Inicie permitindo que as colônias de células-tronco embrionárias humanas cresçam por cinco a sete dias e, em seguida, prepare-se para dividir algumas delas. Selecione colônias com mais de 75% de células-tronco embrionárias humanas indiferenciadas. Elas geralmente são levemente opacas, com bordas definidas e contêm células empilhadas. Um indicativo do início da diferenciação é geralmente o aparecimento de colônias brancas; colônias contendo principalmente células diferenciadas geralmente parecem claras.

Não selecione colônias brancas ou transparentes. Segure as placas contra a luz e use uma caneta para delinear as colônias levemente opacas na parte inferior das placas, seguindo seus contornos. Use a borda de uma ponteira estéril de pipeta P2 para destacar a camada de fibroblastos ao redor da colônia de células-tronco embrionárias humanas.

Em seguida, remova as células fibroblásticas ao redor e também remova todas as partes diferenciadas da colônia. Agora aspire o meio antigo contendo as células diferenciadas destacadas. A seguir, em cada poço, lave as células indiferenciadas uma vez com meio para células-tronco embrionárias humanas sem BFGF e, então, adicione três mililitros de meio fresco para células-tronco embrionárias humanas contendo B-F-G-F-B-F-G-F, adicionado ao meio fresco imediatamente antes do uso.

Agora, use uma ponteira estéril de pipeta P2 para cortar as colônias em pequenos pedaços e destacá-las da placa. Aspire os pedaços das colônias destacadas com seu meio para um tubo cônico de 50 mililitros. Aspire um enxágue adicional de um mililitro de meio por poço.

As células estão agora prontas para sofrerem diferenciação adicional utilizando moléculas pequenas. Comece aquecendo as placas recém-revestidas a 37 graus Celsius. Aspire a solução de revestimento das placas e adicione um alíquota de quatro mililitros de meio contendo fragmentos de colônias em cada poço, em seguida transfira cuidadosamente as placas para uma incubadora sem agitá-las.

Não perturbe as placas para que as células possam aderir. Em seguida, remova a maior parte do meio antigo, deixando apenas quantidade suficiente de meio para que as células permaneçam submersas. As células nunca devem ser deixadas secar.

Misture meio ESL humano fresco contendo FGF básico e nicotinamida e adicione o volume calculado em mililitros deste meio a cada poço. O meio pode ser armazenado por até duas semanas a quatro graus Celsius, período durante o qual pode ser usado para renovar a cultura celular a cada dois dias para promover o crescimento das colônias. Após oito a 10 dias, as células terão sofrido alterações na morfologia, tornando-se grandes células diferenciadas que se multiplicaram e acumularam.

Em seguida, prossiga com um cultivo em suspensão: para iniciar um cultivo em suspensão, comece destacando colônias de ESL das células que se diferenciaram espontaneamente e migraram para formar uma camada de fibroblastos. Utilize a técnica mencionada anteriormente com uma ponteira estéril, depois aspire o meio antigo contendo células de fibroblastos destacadas em suspensão. Lave as células uma vez com meio HESC e re-suspenda-as em três mililitros de meio HESC, utilizando agora uma ponteira estéril P2.

Corte as colônias em pequenos pedaços e desprenda-as da placa. Aspire o meio com as colônias destacadas para um único tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue as cavidades com um mililitro de meio e adicione o enxágue ao pool.

Em seguida, alíquotas de quatro mililitros das células agrupadas em cada poço de uma placa de seis poços com aderência ultra-baixa por quatro a cinco dias. Mantenha a placa em uma incubadora para permitir a formação de agregados celulares flutuantes ou cardio-blastos, promovendo a diferenciação dos cardio-blastos para o fenótipo de cardiomiócitos contráteis. Reúna-os em um tubo cônico de 50 mililitros com seu meio de cultura.

Em seguida, centrifugue as células a 1.400 RPM por cinco minutos. Aspire, pese o máximo possível do meio antigo e adicione uma quantidade igual de meio fresco de diferenciação cardíaca contendo nicotinamida 10 milimolar.

Misture os cardio blasts flutuantes com pipetagem, depois alíquota quatro mililitros da suspensão de cardio blasts em cada poço de placas de cultura de tecidos de seis poços. Transfira as placas para um incubador úmido a 37 graus Celsius para permitir que os cardio blasts adiram às placas de cultura de tecidos durante a noite. A cada dois dias em cultura.

Substitua o meio de diferenciação cardíaca contendo 10 minimois de nicotinamida no oitavo dia. Mude para diferenciação cardíaca. O meio sem nicotinamida deve continuar sendo substituído a cada dois dias.

Em até duas semanas após a retirada da nicotinamida, cardiomiócitos contráteis começarão a surgir e aumentar em número. A nicotinamida mostrou-se suficiente para induzir células-tronco embrionárias humanas mantidas no sistema de cultura definido a transitar da pluripotência exclusivamente para um fenótipo cardio-mesodérmico. Após a exposição de células-tronco embrionárias humanas indiferenciadas à nicotinamida, todas as células dentro da colônia sofreram alterações morfológicas, transformando-se em células diferenciadas maiores que reduziram a expressão de OCT4. As células também começaram a expressar o fator de transcrição cardíaco específico NKX2.5 e a expressar alfa-actinina.

Ambas as características são consistentes com o fenótipo de mesoderma cardíaco. Essas células diferenciadas continuam a se multiplicar e aumentar de tamanho em áreas das colônias onde as células se acumularam. A expressão de NKX 2.5 tornou-se mais intensa após a dessanexação, as células-tronco humanas tratadas com nicotinamida formaram cardioblastos em cultura de suspensão.

Após permitir que os cardio blasts se aderissem, os cardio blasts foram tratados com nicotinamida por uma semana; uma a duas semanas após a retirada da nicotinamida, cardiomiócitos contráteis começaram a surgir com um aumento drástico na eficiência. Eles apareceram como aglomerados celulares que pulsavam com contrações rítmicas; a diferenciação espontânea multilinagem de células que não passaram pelo tratamento IDE não expressou essas características. As células dentro dos aglomerados de cardiomiócitos contráteis expressaram marcadores característicos de cardiomiócitos, incluindo NK X 2.5 e alfa actinina.

As contrações dos cardiomiócitos pulsantes foram confirmadas por perfis elétricos como sendo fortes, rítmicas e coordenadas, além de bem sincronizadas; exibiam impulsos regulares semelhantes aos complexos P-Q-R-S-T observados em eletrodos de superfície corporal em eletrocardiogramas clínicos. Além disso, os cardiomiócitos podiam manter sua forte contratilidade por mais de três meses, uma vez dominada a técnica. Este método pode ser utilizado para gerar precursoras cardíacas e cardiomiócitos pulsantes de forma uniforme a partir de células-tronco embrionárias humanas pluripotentes em cerca de cinco semanas, caso seja realizado corretamente.