Mapeamento de heterogeneidade de expressão da proteína em tumores usando imunofluorescência Quantitative

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar com precisão a expressão de biomarcadores em seções inteiras de tecido de câncer humano, a fim de atribuir um valor numérico ao grau de heterogeneidade na expressão de proteínas. Isso é conseguido primeiro escaneando seções de tecido canceroso marcadas com imunofluorescência usando um scanner fluorescente de lâmina inteira. As próximas regiões de interesse dentro do tumor são selecionadas para avaliação.

Em seguida, a expressão da proteína de interesse dentro das áreas tumorais invasivas é quantificada usando o sistema automatizado de análise de imagem de análise de água. Em última análise, esse método pode ser usado para mapear a expressão de biomarcadores no tecido cancerígeno, que geralmente é muito heterogêneo na seção do tecido. A principal vantagem de usar essas técnicas em relação aos métodos tradicionais, como imuno-histoquímica usando reagentes de visualização colorida e métrica, é que a imunofluorescência é mais quantitativa e mais sensível.

Acoplando esses métodos analíticos a uma seção inteira, a varredura por imunofluorescência permite o mapeamento de grãos finos de variações sutis na expressão de biomarcadores nos tecidos. Pela primeira vez, demonstrando esses procedimentos está Mark Gustafson, diretor direto de operações do laboratório Histo RX. Após o micrótomo, seccionamento de uma biópsia de tecido cancerígeno e coloração imunofluorescente da amostra para expressão dos biomarcadores de interesse, carregue até cinco lâminas das seções coradas no de lâminas do scanner de lâminas.

Em seguida, usando a interface no console do escopo de varredura. Para cada lâmina, selecione uma região para abranger todo o tecido da lâmina, independentemente do padrão de coloração ou de outros aspectos observáveis da amostra. Em seguida, usando o console do escopo de varredura, primeiro selecione uma região do tecido para avaliar idealmente dentro da região do tumor do tecido para fornecer a melhor representação.

Agora, usando o recurso de exposição automática do console do escopo de varredura, determine o tempo de exposição para cada canal junto com o foco da imagem, use o losango azul na imagem do console do escopo de varredura para selecionar uma região adicional longe do tecido, mas ainda dentro da região do slide sob a lamínula para definir a área de fundo onde as imagens de correção de campo plano serão adquiridas. Para cada filtro, adicione pontos de foco à área do tecido representada por quadrados amarelos para otimizar a captura da imagem. Se as imagens parecerem ter um plano de fundo alto ou outros artefatos de imagem, a região da imagem deverá ser movida e novas imagens adquiridas.

O tecido é então escaneado e as imagens digitais de lâminas adquiridas são carregadas automaticamente no banco de dados de espectro da Aperio. Clique duas vezes na imagem em miniatura do programa de espectro para selecionar o slide para análise na lista de slides digitais no banco de dados do espectro. Em seguida, usando a imagem anotada h e D que acompanha, anote a região de interesse na imagem fluorescente.

Várias regiões de interesse delineadas com círculos individuais podem ser selecionadas em uma única amostra. As imagens anotadas são salvas automaticamente no banco de dados do espectro. Agora selecione Analisar na barra de menus na parte superior da tela quando a janela de análise aparecer, selecione histo RX aqua analysis no menu suspenso.

Quando estiver pronto para começar, pressione o botão analisar, Uma janela minimizada do console aparecerá na barra de tarefas do Windows exibindo o progresso da transferência das imagens do banco de dados Spectrum para o computador local. Uma vez que os dados tenham sido transferidos, a análise aquática será iniciada para gerar uma pontuação aquática usando um algoritmo de pontuação aquática não supervisionado com base no agrupamento de dados de um primeiro limite de amostra, o sinal de imagem de citoqueratina pan acima do sinal de imagem de fundo. Isso permitirá o uso dos pixels para definir uma máscara tumoral que poderá ser usada para cálculos subsequentes.

Use os pixels de alta expressão de pan citoqueratina para definir também as regiões citoplasmáticas ou não nucleares das células tumorais. Como visto aqui, os pixels com um sinal alto no canal DPI que estão dentro da máscara tumoral são identificados como de natureza nuclear. Se, após a revisão, forem identificados campos que não eram adequados para pontuação devido a artefatos de amostra ou imagem, esses campos serão suprimidos da pontuação e também produzirão um resultado final de falha.

Os resultados da pontuação aqua são representados como uma tabela de pontuações associadas a cada bloco de 512 por 512 pixels na região de interesse em uma amostra de seção de tecido inteiro, que pode ser salva e usada para análise estatística subsequente. Essas micrografias de fotos coradas com hemat toin e eoin demonstram como diferentes áreas do mesmo câncer de ovário podem exibir morfologia variável. A visão de alta potência no canto superior direito da Figura B destaca células com limpeza citoplasmática e um padrão sólido de crescimento na parte superior do tumor.

A parte inferior do tecido ampliada na seção inferior direita da Figura C, no entanto, tem um citoplasma eosinofílico mais homogêneo e um padrão de crescimento papilar. Aqui, mapas de calor de heterogeneidade da expressão de ER em uma seção de tecido de câncer de ovário antes e depois de um tratamento quimioterápico são mostrados nos painéis superior e inferior, respectivamente. Observe a mudança da expressão de ER variável em toda a seção com regiões de alta e baixa expressão na figura superior para uma distribuição uniforme de alta expressão de ER ilustrada em vermelho na figura inferior.

A representação numérica dessa mudança é indicada à esquerda pela diminuição do índice dos Simpsons. Nesta figura, os mapas de calor de heterogeneidade de HER, dois em uma seção de tecido do câncer de ovário, são mostrados novamente antes e depois da terapia, conforme visto nos painéis superior e inferior, respectivamente. Observe novamente a mudança da variável HER duas expressões em toda a seção com regiões de alta e baixa expressão na figura superior para uma distribuição uniforme de alta expressão HER dois na figura inferior.

Mais uma vez, o índice dos Simpsons diminui. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade dos dados gerados pela análise computacional é tão boa quanto a qualidade da coloração, e isso deve ser de alto padrão técnico.