Mapeamento de heterogeneidade de expressão da proteína em tumores usando imunofluorescência Quantitative

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar com precisão a expressão de biomarcadores em seções completas de tecido tumoral humano, a fim de atribuir um valor numérico ao grau de heterogeneidade na expressão proteica. Isso é alcançado primeiramente escaneando seções de tecido tumoral marcadas por imunofluorescência utilizando um escâner fluorescente de lâmina inteira. Em seguida, são selecionadas regiões de interesse dentro do tumor para avaliação.

Em seguida, a expressão da proteína de interesse nas áreas tumorais invasivas é quantificada utilizando o sistema automatizado de análise de imagens aqua analysis. Em última instância, este método pode ser usado para mapear a expressão de biomarcadores em tecido tumoral, que frequentemente é muito heterogêneo ao longo da seção do tecido. A principal vantagem do uso dessas técnicas em comparação com métodos tradicionais, como a imuno-histoquímica com reagentes de visualização colorimétrica e métrica, é que a imunofluorescência é mais quantitativa e mais sensível.

Associar esses métodos analíticos a uma varredura de imunofluorescência em seção inteira permite o mapeamento detalhado de variações sutis na expressão de biomarcadores nos tecidos. Pela primeira vez, demonstrando esses procedimentos, Mark Gustafson, diretor direto de operações no laboratório Histo RX. Após o microtomo, corte de uma biópsia de tecido canceroso e coloração por imunofluorescência do espécime para expressão dos biomarcadores de interesse, carregue até cinco lâminas com as seções coradas na cassete de lâminas do escâner de lâminas.

Em seguida, utilizando a interface no console do microscópio de digitalização. Para cada lâmina, selecione uma região que englobe todo o tecido na lâmina, independentemente do padrão de coloração ou outros aspectos observáveis da amostra. A seguir, utilizando o console do microscópio de digitalização, primeiramente selecione uma região de tecido para avaliação, idealmente dentro da região tumoral do tecido, para fornecer a melhor representação possível.

Agora, utilizando a função de exposição automática do console do scan scope, determine o tempo de exposição para cada canal juntamente com o foco da imagem. Use o losango azul na imagem do console do scan scope para selecionar uma região adicional distante do tecido, mas ainda dentro da região da lâmina sob a lamínula, a fim de definir a área de fundo onde serão adquiridas as imagens de correção de campo plano. Para cada filtro, adicione pontos de foco à área do tecido representada pelos quadrados amarelos para otimizar a captura da imagem. Se as imagens apresentarem fundo elevado ou outros artefatos, a região da imagem deve ser movida e novas imagens devem ser adquiridas.

O tecido é então escaneado e as imagens digitais do lâmina adquiridas são automaticamente enviadas para o banco de dados Aperio Spectrum. Dê um duplo clique na imagem em miniatura para o programa Spectrum selecionar a lâmina para análise a partir da lista de lâminas digitais no banco de dados Spectrum. Em seguida, utilizando a imagem anotada de h e D fornecida, anote a região de interesse na imagem fluorescente.

Várias regiões de interesse delimitadas com círculos individuais podem ser selecionadas em uma única amostra. As imagens anotadas são salvas automaticamente no banco de dados de espectros. Agora, selecione Analisar na barra de menu na parte superior da tela; quando a janela de análise aparecer, selecione a análise histo RX aqua no menu suspenso.

Quando estiver pronto para começar, pressione o botão analisar. Uma janela de console minimizada aparecerá na barra de tarefas do Windows exibindo o progresso da transferência das imagens do banco de dados Spectrum para o computador local. Uma vez que os dados tenham sido transferidos, a análise aqua será iniciada para gerar uma pontuação aqua utilizando um algoritmo de pontuação aqua não supervisionado baseado no agrupamento de dados de um primeiro limiar da amostra, do sinal da imagem de pancitoceratina acima do sinal de fundo da imagem. Isso permitirá o uso dos pixels para definir uma máscara de tumor que então poderá ser utilizada para cálculos subsequentes.

Utilize os pixels de alta expressão de pan-citoqueratina para também definir as regiões citoplasmáticas ou não nucleares das células tumorais. Como visto aqui, os pixels com sinal alto no canal DPI que estão dentro da máscara tumoral são identificados como sendo de natureza nuclear. Se, ao revisar, forem identificados campos que não são adequados para pontuação devido a artefatos da amostra ou da imagem, esses campos são excluídos da pontuação e também resultarão em um resultado final de falha.

Os resultados da pontuação aqua são representados como uma tabela de escores associados a cada ladrilho de 512 por 512 pixels na região de interesse dentro de uma amostra completa de seção tecidual, que pode ser salva e utilizada para análises estatísticas subsequentes. Essas fotomicrografias coradas com hematoxilina e eosina demonstram como diferentes áreas do mesmo câncer de ovário podem exibir morfologia variável. A vista em alto aumento no canto superior direito da Figura B destaca células com clareamento citoplasmático e um padrão de crescimento sólido na parte superior do tumor.

A parte inferior do tecido ampliada na seção inferior direita da Figura C, no entanto, apresenta um citoplasma eosinofílico mais homogêneo e um padrão de crescimento papilar. Aqui, são mostrados os mapas térmicos de heterogeneidade da expressão de RE em uma seção de tecido de câncer de ovário antes e após um tratamento com quimioterapia, respectivamente nos painéis superiores e inferiores. Observe a mudança de uma expressão variável de RE ao longo da seção, com regiões de expressão alta e baixa na figura superior, para uma distribuição uniforme de alta expressão de RE ilustrada em vermelho na figura inferior.

A representação numérica dessa alteração é indicada à esquerda pela diminuição do índice de Simpson. Nesta figura, são mostrados novamente os mapas térmicos de heterogeneidade de HER2 em uma seção de tecido de câncer de ovário antes e após a terapia, conforme visto nos painéis superior e inferior, respectivamente. Observe novamente a mudança de expressão variável de HER2 ao longo da seção, com regiões de expressão alta e baixa na figura superior, para uma distribuição uniforme de alta expressão de HER2 na figura inferior.

Mais uma vez, observa-se que o índice de Simpson diminui. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade dos dados gerados pela análise computacional é tão boa quanto a qualidade da coloração, a qual deve atingir um alto padrão técnico.