Name: Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Aprenda a avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento em fluxo laminar usando uma câmara de placas paralelas e circuito de fluxo contínuo estéril.

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Os autores gostariam de agradecer a Joe Owen no instrumento Biomédica e Machine Shop por seus esforços incansáveis ​​em usinagem e montagem das peças fluxo de câmara e Matt Maudsley da Leica Microsystems para auxiliar nas técnicas de imagem para as células através de câmaras de fluxo. Somos gratos a Kevin Collins dos Serviços de Perfusão Duke e Dr. Steve Wallace no Departamento de Engenharia Biomédica para sugestões úteis sobre projeto de circuito de fluxo. Gostaríamos também de agradecer à National Science Foundation Graduate Fellowship Program Research para apoiar Alexandra Jantzen e os NIH por seu apoio através de Grant &quot;forro autólogo EPC para melhorar a biocompatibilidade de dispositivos de assistência circulatória&quot; RC1HL099863-01.

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O nosso circuito de fluxo e câmara de fluxo nos permitem assunto células aderentes, EPCs por exemplo, para tensões de cisalhamento definida fluido. Desde o compartimento superior e inferior são de adesão, transparente e morfologia celular pode ser avaliado tanto em tempo real, através da câmara em si, ou depois de uma experiência de fluxo e desmontagem da câmara de fluxo. Nesse ponto, as células podem ser colhidas em condições estéreis e ou re-banhado, ou usado para coletar seu DNA ou RNA, etc, para posterior análise. Para conseguir um fluxo laminar, o desenho da câmara deve ser tal que várias condições sejam cumpridas. Primeiro, o fluxo deve ser laminar, que pode ser verificado através do cálculo o número de Reynolds (Re), que é a razão entre forças inerciais às forças viscosas. (Se as forças viscosas predominam, Re é pequeno eo fluxo é laminar ou 'plenamente desenvolvido' - geralmente para Re &lt;2300.Se as forças de inércia predominam, o fluxo se torna mais e mais aleatória até que seja turbulento, como é o caso para Re&gt; 4000). Podemos calcular Re acordo com a equação 3 8, <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 3"> Onde ρ é a densidade do fluido, Q é a vazão, μ é a viscosidade, w e h são a largura ea altura da câmara, respectivamente, e D h é o diâmetro hidráulico, definido de acordo com a equação 4 8, <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 4"> O número de Reynolds do nosso fluxo de câmaras de três, com alturas que variam de 166-267 M, faixa 13,9-34,6 a taxas de fluxo de calculated para obter uma tensão de cisalhamento de 15 dinas / cm 2. Em taxas de fluxo calculado para uma tensão de cisalhamento de 100 dinas / cm 2, o número de Reynolds das câmaras variou de 90,4-234. Todos estes números são muito mais baixos Reynolds de 2300 e atender o critério de fluxo laminar. Segundo, para o campo de velocidade e tensão de cisalhamento para ser independente da distância ao longo do canal de fluxo (ou seja, totalmente desenvolvido), a distância entre a entrada de líquido para o slide deve ser maior que o comprimento de entrada, e L. Isto pode ser satisfeita por meio do cálculo do comprimento de entrada, conforme a equação 5 9. <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 5"> Para os valores listados acima, o comprimento de entrada varia de 0,01 a 0,25 centímetros. Terceiro, a fim de garantir que a velocidade ea tensão de cisalhamento na direção laterais não variamsignificativamente do valor de fluxo unidimensional canal (Δ Ph / 2L), a relação h / w deve ser muito menor que 1. Para a tensão média de cisalhamento de parede em condições bidimensionais fluxo a ser de 95% da tensão de cisalhamento parede sob unidimensional de fluxo, h / w deve ser igual a 0,10, e para a tensão de cisalhamento de parede em condições bidimensionais de fluxo para ser 97,5% da tensão de cisalhamento parede sob unidimensional de fluxo, h / w deve ser igual a 0,05. Com as dimensões da nossa câmara de fluxo projetado 1,7 centímetros de largura e 166-267 M de altura, estes critérios estão preenchidos. A pressão vai variar apenas na direção do fluxo, se não houver gradientes de pressão lateral na entrada. Isto pode ser avaliada utilizando corantes ou partículas no caminho de fluxo. Além disso, para experimentos de fluxo contínuo, um amortecedor de pulso é inserido no circuito de fluxo. O amortecedor de pulso tira a maior parte do pulsatility causada pela bomba de roletes no circuito, e nos permite a assunção aproximado de fluxo constante. De nota, o amortecedor de pulso utilizada deve ser compatível com a bomba e tubos utilizados no circuito, de modo que ele pode efetivamente eliminar pulsações no fluxo de saída para as freqüências específicas da bomba de rolete. Em nossa demonstração do Masterflex L / S amortecedor de pulsações atinge fluxo laminar, quando utilizado na linha de descarga com qualquer bomba série Masterflex L / S (0-600 RPMs) e I / P tubo 26. Para o fluxo pulsátil, uma bomba programável pode ser usado para gerar formas de onda diferentes. Para o fluxo pulsátil, uma bomba programável pode ser usado para gerar formas de onda diferentes. Além disso, o circuito é projetado de tal forma que as amostras de perfusato pode ser facilmente coletadas em momentos diferentes sem o risco de contaminação das células ou médio fluxo. No nosso exemplo, a concentração de NO 2 - foi medido por quimioluminescência comum Ionics / Sievers Analyzer óxido nítrico (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO), como descrito anteriormente 10. O redutor usado para análise de nitrito foi de iodeto de potássio em ácido acético (14,5 M de ácido acético e 0,05 M KI), que tem o potencial de redução para converter o nitrito a NO, mas é insuficiente para reduzir qualquer óxidos de nitrogênio superiores tais como o nitrato e, portanto, é relativamente específico para nitrito. O nitrito total produzido foi calculado como o produto da concentração produzida eo volume total do circuito, enquanto o ajuste de volume perdido, enquanto a recolha de amostras 6. Os passos seguintes são críticos para a execução bem sucedida de experimentos de fluxo: <ol class="lroman"><li> É desejável para evitar formação de bolhas durante o fluxo de set-up, uma vez que as bolhas têm o potencial para arrancar as células de sua superfície. Isto pode ser evitado tomando cuidado ao colocar a parte superior da câmara de fluxo para a parte inferior, o que é melhorrealizado, mantendo ambos paralelos entre si e diminuindo o topo para o fundo em um movimento sem reajustes. Ao fazer isso, pequenas bolhas de ar que possam estar presentes e / ou flutuando no canal de fluxo, serão desviados para as armadilhas de bolha em cada extremidade da carcaça de alumínio. </li><li> É importante assegurar que a tubulação de saída do reservatório desce para o fundo do reservatório. Caso contrário, o ar pode ser sugado para dentro do tubo que conduz a partir de reservatório para a câmara se o nível de perfusato cai ligeiramente abaixo da extremidade da tubulação. </li><li> O pesquisador deve estar familiarizado com a direção do fluxo da bomba para que a bomba não acidentalmente correr na direção oposta ao início do fluxo, o que resultaria no ar sendo sugado para dentro do circuito e de câmara. </li><li> Para evitar a formação de espuma (devido às proteínas desnaturadas contidas no soro), aconselhamos baixar o tubo que conduz da câmara para o reservatório a aproximadamente uma polegada acima do perfusate de nível dentro do reservatório. No entanto, mantendo-o acima do nível médio de fluxo lhe permite verificar o fluxo no reservatório durante o experimento. </li><li> Quando unir as peças de câmara em conjunto, é importante agarrar firme a habitação com uma das mãos ao operar a chave de fenda elétrica com a outra mão. Note que o movimento da chave de fenda elétrica será traduzido em torque que tem o potencial de "arremessar a câmara em torno de" uma vez que o parafuso é apertado. </li><li> Para evitar qualquer ondas de pressão de formação no circuito e levantamento de células fora de sua superfície, assegurar que todas as torneiras estão abertos antes de iniciar o fluxo. </li><li> Especialmente para estudos de fluxo de longo prazo (&gt; 48 horas) recomendamos o uso do tubo mais duro e mais resistente para ser inserido na cabeça da bomba para impedir a quebra da tubulação. </li><li> É possível que os tubos 'migra' dentro da cabeça da bomba devido a mal-ajustadas dentes cabeça da bomba. Portanto, sugerimos prestando muita atenção à forma como a banheiraing é garantido na cabeça da bomba e marcar cada extremidade do tubo com uma caneta marca de tal forma que você pode facilmente perceber se o tubo é 'puxado' ou deslocada durante o experimento. </li><li> Sempre verifique cuidadosamente cada conector único do circuito e da câmara antes de iniciar a perfusão, a fim de evitar fugas de perfusato durante um experimento devido a uma conexão defeituosa. Isto é especialmente importante para os conectores de entrada e saída de amortecedores de pulso! </li><li> Lembre-se de limitar a exposição à luz, se você usar etiquetas fluorescentes. </li></ol> Uma possível limitação do nosso câmara de fluxo é que a altura é fixado pela altura do canal usinado no alumínio. No entanto, este tem a vantagem de não ter que verificar e ajustar a altura do canal antes de cada experiência e, portanto, simplifica os cálculos tensão de cisalhamento por apenas ajustando o fluxo da bomba para o valor desejado. Dependendo de seus objetivos de pesquisa, pode ser desejávelaumentar a tensão de cisalhamento sem aumentar a velocidade da bomba. Neste caso, recomendamos o aumento da viscosidade do perfusato é, por exemplo, a adição de dextran a 11 médio. Uma possível limitação do circuito de fluxo é o grande volume de meio utilizado, que pode ser problemático quando se tenta quantificar concentrações muito pequenas de metabólitos celulares. Embora não seja mostrado aqui, é possível reduzir substancialmente o volume do circuito usando um reservatório menor e amortecedor de pulso e diminuir comprimento da tubulação e diâmetro. Além disso, existem vários outros sistemas disponíveis no mercado que podem ser usados ​​para aplicar tensão de cisalhamento de fluidos para células em cultura. Sistemas baseados em microfluídica, por exemplo, o sistema de BioFlux Fluxion, permitem análises simultâneas de células em diferentes canais de fluxo microfluídicos carregado com solução em placas bem atuando como reservatórios de entrada e de saída para estes canais 12,13,14. No entanto, essas e outras microsistemas fluídicos não são compatíveis com lâminas de microscópio padrão e não permitir a recuperação de um número suficientemente grande de células para novas experiências, tais como RT-PCR ou Western Blot. Além disso, eles são menos user-friendly, um custo mínimo de US $ 40.000 e pode chegar a um total de mais de US $ 100.000, dependendo do equipamento acessório. Dois sistemas macrofluidic disponível a partir do FlexCell Internacional Corporation, o Streamer FlexCell e os sistemas FlexFlow, tem sido utilizado com sucesso para estudar células endoteliais 15,16,17, as células humanas anel 18 e 19 fibroblastos em condições de escoamento de fluidos. Um terceiro sistema, disponível através GlycoTech, tem sido utilizada para estudar a adesão de células tumorais 20 e 21 a adesão de leucócitos monocamadas endoteliais. O sistema permite Streamer vários slides para serem executados sob as mesmas condições de tensão de cisalhamento de uma só vez, mas carece de uma janela de visualização e - ao contrário de nossosdesign - não permite a visualização em tempo real de células em fluxo. O sistema FlexFlow tem uma janela de visualização, mas requer um microscópio vertical, que pode não ser o microscópio padrão usado na maioria dos laboratórios. Além disso, o sistema exige uma FlexFlow lamínula célula revestido de ser invertida quando colocado na câmara de fluxo. Isto impede a visualização de células fluorescentes em uma superfície opaca, como o titânio revestido de vidro, que demonstramos em nosso estudo. Por último, o lamínulas especializados precisam ser comprados especificamente para o sistema FlexFlow, que é na faixa de preço de vários mil dólares, similar ao sistema Streamer FlexCell. GlycoTech oferece circular e retangular câmaras de placas paralelas de fluxo, que são significativamente menos caro, mas fabricados a partir de acrílico moldado que não podem ser convenientemente tronco autoclavado como a nossa câmara. De nota, câmaras de fluxo de outras que têm sido descritos para ser autoclavávelparecem impraticáveis, pois requerem especial lentes microscópicas 22,23. O sistema utiliza GlycoTech juntas de borracha de silicone interposta entre as placas superior e inferior, que mudará de espessura com o uso repetido e, portanto, alterar a altura da câmara ao longo do tempo (o fabricante recomenda a compra de novas a cada dez usa). Nossa câmara de alumínio com built-in O-rings permite a completa oposição de placas superior e inferior e altura da câmara garante constante entre experimentos. Por último, bombas de vácuo são necessárias para alcançar um selo à prova de vazamentos em projetos de câmara de fluxo de muitos, incluindo as câmaras GlycoTech, que não são necessárias em nosso projeto. Considerando não mostrado aqui, a câmara de fluxo pode ser mantido sob um microscópio durante o experimento de vazão em tempo real imagens de adesão celular e / ou comportamento. Se isso for desejado, recomendamos usar lâmpadas de calor ou uma almofada de aquecimento sob a câmara para manter a temperatura do perfusato a 37 ° C. Pelelá, a bomba de roletes pode ser substituído por uma bomba de seringa, se não "recirculação" da células ou metabólitos ou droga investigacional ou agentes é desejado 24. Também é possível ao fluxo de células de maneira diferente rotulados sobre células aderentes, por exemplo, plaquetas fluorescentes sobre uma camada de EPCs confluentes (utilizando o ensaio de plaquetas descrito por Achneck et al. 6,25) para avaliar a célula a célula-interação sob tensão de cisalhamento do fluido. Nossa câmara de fluxo combina recursos valiosos de outras câmaras de fluxo disponíveis, como uma porta de amostragem perfusato e uma janela de visualização e tem a importante vantagem de compatibilidade com qualquer um microscópio invertido ou vertical. É totalmente autoclavável e permite experimentos repetidos na altura da câmara constante e sem a necessidade de bombas de vácuo para conseguir um selo à prova de fugas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Produtos / Reagentes </td><td> Companhia </td><td> Produto # </td></tr><tr><td> Seringa de 10 ml </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> Seringa 30 ml </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way Torneiras </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> Liga de alumínio </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Cultura de células-Pratos (4-bem, rectangular) </td><td> Thermo Scientific; Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Rastreador de celular Laranja </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Organics pesquisa </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Adaptador Luer fêmea </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F0895-2mg </td></tr><tr><td> Garrafa de vidro (250ml) com Cap </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Tubos rígidos </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst Solution Stain </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Adaptador Luer macho </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1X Médio </td><td> Cellgro </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Acessórios polipropileno farpado </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Rings </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulso-amortecedor </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Bomba de acionamento (Masterflex L / S disco economia de velocidade variável) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Bomba-Head (Cabeça da bomba Masterflex Fácil Load) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Slide </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Tubulação macia </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Seringa filtro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox Nucleic Acid Orange Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Solução de tripsina Neutralizing </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

câmara de placas paralelas de fluxo e circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento fluxo laminar

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

O objetivo geral deste método é descrever uma técnica para assunto células aderentes às condições de fluxo laminar e avaliar sua resposta ao cisalhamento de fluidos bem quantificáveis ​​sublinha 1. Nosso projeto de câmara de fluxo e circuito de fluxo (Fig. 1) contém uma região de visualização transparente que permite o teste de adesão celular ea imagem da morfologia das células imediatamente antes de fluxo (Fig. 11A, B), em momentos diferentes durante o fluxo (Fig. 11C) , e depois de fluxo (Fig. 11D). Estes experimentos são ilustrados com cordão umbilical humano derivados do sangue células progenitoras endoteliais (EPCs) e suínos EPCs 2,3. Este método é também aplicável a outros tipos de células aderentes, por exemplo, células musculares lisas (PMEs) ou fibroblastos. A câmara e todas as partes do circuito são facilmente esterilizados com autoclavagem a vapor. Em contraste com outroscâmaras, por exemplo, câmaras de microfluídica, um grande número de células (&gt; 1 milhão, dependendo do tamanho da célula) podem ser recuperados após o experimento de fluxo sob condições estéreis para cultura de células ou de outros experimentos, por exemplo, DNA ou extração de RNA, ou imuno-histoquímica (Fig. 11E), ou microscopia eletrônica de varredura 5. A tensão de cisalhamento pode ser ajustado pela variação da taxa de fluxo do perfusato, a viscosidade do fluido, ou a altura ea largura do canal. Este último pode reduzir o volume de fluido ou necessidades célula, assegurando simultaneamente que unidimensional de fluxo é mantida. Não é necessário para medir a altura da câmara entre os experimentos, uma vez que a altura da câmara não depende do uso de juntas, o que aumenta a facilidade de múltiplas experiências. Além disso, o projeto de circuito facilmente permite a coleta de amostras de perfusato para análise e / ou quantificação de metabólitos secretados pelas células sob exposição ao estresse de fluidos de corte, o óxido nítrico por exemplo (Fig. 12) 6 </sup&gt;.

Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

O objetivo geral deste método é descrever uma técnica para submeter células aderentes a condições de fluxo laminar e avaliar a sua resposta a...

O objetivo geral deste artigo em vídeo é descrever uma técnica para submeter células aderentes a condições de fluxo laminar e avaliar a resposta a tensões cisalhantes do fluido bem quantificáveis. Isso é realizado primeiramente montando o circuito de fluxo sem a câmara de fluxo. O circuito inclui o pulso do reservatório, amortecedor de pulsação, tubos rígidos, tubos flexíveis, torneiras de quatro vias e conectores tipo lure acoplados, bem como um filtro de ar.O próximo passo é preencher o circuito com o fluido desejado, como meio celular, em condições estéreis, e então iniciar a bomba para encher o amortecedor de pulso e remover o ar dos tubos. Em seguida, insere-se a lâmina com as células na placa inferior da câmara de fluxo. O passo final do procedimento é a montagem completa do circuito de fluxo, com a câmara de fluxo conectada em linha.Resultados finais podem ser obtidos demonstrando o alinhamento de células progenitoras endoteliais marcadas com fluorescência sob exposição a tensão cisalhante do fluido, por meio de uma câmara transparente utilizando microscopia de fluorescência. Para estudar o comportamento funcional das células, é frequentemente necessário imitar a fisiologia in vivo submetendo as células à tensão cisalhante do fluido. Nós desenvolvemos uma câmara de fluxo com placas paralelas e um circuito de fluxo contínuo, que nos permitem estudar as células sob condições de fluxo e observá-las através da câmara transparente.Essa técnica pode servir como uma ferramenta de pesquisa valiosa para as áreas de medicina e engenharia. Nossa câmara de fluxo permite a visualização intermitente ou em tempo real de células sob fluxo, utilizando microscópio ereto ou invertido. Além disso, o design do Dr. Ach Nick permite aos pesquisadores imaginar células em superfícies transparentes ou radiopacas usando lentes de microscópio padrão.Além disso, pode ser uma ferramenta importante na pesquisa farmacológica para estudar o efeito de fármacos sobre células sob condições de fluxo. A visualização da montagem é fundamental, pois várias das etapas são difíceis de dominar apenas lendo um protocolo. Vou fornecer instruções passo a passo sobre como montar a câmara de fluxo e o circuito de fluxo comumente utilizados no laboratório do Dr. Ock Next para montar o circuito de fluxo.Inicie conectando um segmento de tubo rígido de 36 polegadas a uma extremidade de um amortecedor de pulso e a outra extremidade. Conecte um segmento de tubo flexível de 18 polegadas. Coloque um adaptador macho de encaixe de um oitavo de polegada na extremidade do trecho de tubo flexível de 18 polegadas.Conecte a isca macho a um adaptador fêmea de um oitavo de polegada. Prenda a isca fêmea a um novo segmento de 18 polegadas de tubo flexível. Faça três furos em uma tampa de béquer de vidro de 250 mililitros.Para acomodar a tubulação, insira um segmento de 1,5 polegada de tubo flexível em um dos orifícios, como saída de ar. Insira as extremidades livres dos tubos rígido e flexível pelos outros dois orifícios na tampa, dentro do frasco de vidro de 250 mililitros, que funcionará como reservatório.Certifique-se de que o tubo rígido alcance o fundo do reservatório. A manutenção da esterilidade durante toda a montagem do circuito é crucial para o sucesso deste procedimento. Portanto, todas as partes devem ser esterilizadas e você deve usar luvas estéreis durante todo o processo.Além das peças montadas, essas peças devem ser esterilizadas. Uma câmara de fluxo completa, três segmentos de tubo flexível de dois polegadas, um macho e um fêmea, um adaptador de encaixe de um oitavo de polegada, quatro parafusos cabeça chata de meia polegada, 6 5 16 polegadas, oito de 30 segundos. Trilhos por polegada, parafusos cabeça chata, um par de pinças, uma lâmina de vidro e duas toalhas esterilizadas por vapor.Autoclavagem a 121 graus Celsius por 60 minutos. Coloque o circuito de fluxo, a câmara de fluxo e as torneiras de passagem quatro por quatro, uma a uma, a torneira de passagem e todas as peças esterilizadas sobre este campo estéril. Usando luvas estéreis, conecte as duas torneiras de passagem de quatro vias.Coloque tampas nos orifícios abertos das amostras. Desconecte os adaptadores macho e fêmea que prendem os dois segmentos de tubo flexível do circuito de fluxo e insira as torneiras conectadas. Conecte o tubo flexível inserido no reservatório a uma seringa de 30 mililitros e remova o êmbolo da seringa.Encha o frasco com 125 mililitros de meio EPC. Reconecte o tubo flexível à torneira de fechamento. Coloque um filtro de seringa estéril na ventilação de ar.Agora transfira o circuito de fluxo para uma estufa umidificada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Prenda o tubo rígido na cabeça da bomba peristáltica Master Flex indicada para uso com este tipo de tubo Palmer de carvão. Certifique-se de que o tubo não sobreponha as trilhas de montagem da bomba peristáltica.Marque o tubo no ponto em que ele sai da cabeça da bomba em ambos os lados com uma caneta marcadora. Após garantir que todas as torneiras de fechamento estão fechadas em direção às portas de amostra e abertas ao longo do circuito de fluxo, ligue a bomba. Verifique o sentido do fluxo.O PERFUSE oito deve fluir desde o reservatório de vidro através do tubo rígido até o amortecedor de pulso. Para a montagem da câmara de fluxo, utilize luvas estéreis para conectar um segmento de tubo flexível de dois polegadas a um adaptador fêmea de um oitavo de polegada. Conecte outro segmento de tubo flexível de dois polegadas a um adaptador macho de um oitavo de polegada.Conecte o tubo macio de duas polegadas com adaptador fêmea tipo lure à porta de entrada e o tubo macio de duas polegadas com adaptador macho tipo lure à porta de saída. Conecte torneiras de quatro vias a ambos os adaptadores tipo lure. Conecte o pedaço restante de tubo macio de duas polegadas ao conector da porta lateral proveniente do captador de bolhas e fixe uma torneira de sentido único utilizando pinças estéreis.Remova a lâmina com células semeadas do recipiente de cultura celular e coloque-a na reentrância da placa inferior da câmara de fluxo. Certifique-se de que a lâmina seja posicionada com o lado contendo as células voltado para cima; utilizando uma seringa ou pipeta, adicione 10 mililitros de meio EPC aquecido sobre a lâmina com células. Deixe o meio cobrir a lâmina dentro da câmara de fluxo, mas evite derramar o meio sobre a junta de vedação (O-ring) na placa inferior.Coloque a placa superior da câmara de fluxo sobre a placa inferior, alinhando os orifícios dos parafusos. Mantenha as duas placas paralelas para não introduzir bolhas de ar na câmara ao parafusar as placas. Usando uma chave de fenda automática operada por bateria, desaerar o coletor de bolhas de entrada abrindo a válvula de retenção unidirecional conectada à porta do coletor de bolhas do lado de entrada.Use uma seringa de 10 mililitros para lavar suavemente o tubo de entrada com o meio EPC e, em seguida, feche esta torneira de fechamento e coloque a tampa. Agora, remova o ar do canal da câmara abrindo a torneira de quatro vias da saída e lavando suavemente o meio EPC através da câmara de fluxo. Novamente usando uma seringa de 10 mililitros, tampe todas as conexões da torneira de quatro vias e feche-as.Transfira a câmara de fluxo para o incubador umidificado com o circuito de fluxo montado. Pause a bomba do circuito de fluxo para fechar o circuito. Feche as torneiras no sentido do fluxo para evitar vazamentos.Conecte a câmara de fluxo ao circuito de fluxo. Após a câmara de fluxo ter sido conectada ao circuito de fluxo, abra as torneiras no sentido do fluxo. Retome a bomba de fluxo e certifique-se de que o PERFUSE eight flua no sentido correto. Ajuste a taxa de fluxo ao estresse cisalhante desejado.Durante o experimento de fluxo, a câmara de fluxo pode ser removida do circuito para visualizar as células por microscopia de luz ou fluorescente. Para isso, desconecte a câmara de fluxo do circuito de fluxo nas conexões da torneira de passagem. Para coletar o perfusato, oito amostras para análise.Primeiro, pare a bomba e feche a torneira de fechamento localizada mais próxima ao amortecedor de pulso. Remova sua tampa protetora, colocando-a de cabeça para baixo para garantir que não seja contaminada. Insira uma seringa pequena no orifício de amostragem.Feche a torneira de fechamento no sentido da câmara de fluxo, mantendo o orifício de amostragem e o circuito no sentido do amortecedor de pulso abertos. Aspire a quantidade desejada de amostra do circuito, feche a torneira em direção ao orifício de amostragem antes de remover a seringa. Armazene a amostra abundante oito em um frasco identificado e congele a menos 80 graus Celsius.Tampe o portão da amostra e certifique-se de que todas as torneiras de passagem estejam abertas antes de iniciar o fluxo. Com este método, células progenitoras endoteliais derivadas de sangue humano podem ser semeadas em lâminas de titânio em até 15 minutos e aderem sob forças de cisalhamento fisiológicas. Conforme mostrado nesta figura, as CPEs se espalham sob a influência do fluxo, passando de cerca de 210 micrômetros quadrados imediatamente após a semeadura para cerca de 657 micrômetros quadrados após três horas e cerca de 1.152 micrômetros quadrados após 48 horas de estresse de cisalhamento de fluido de 15 dina por centímetro quadrado.Esta imagem de microscópio óptico ilustra a orientação aleatória de EPCs humanas. Após um período de adesão estática de seis horas após três horas de fluxo a 100 dines por centímetro quadrado, as células se espalharam, mas permanecem em orientação aleatória. Após 48 horas de estresse por cisalhamento do fluido a 100 dines por centímetro quadrado, as EPCs estão alinhadas e orientadas na direção do fluxo.Aqui, as EPCs foram marcadas com CTO e os núcleos celulares corados com herx para morrer após o fluxo. Para comparação, esta imagem mostra EPCs suínas em lâminas de titânio alinhadas com a direção do fluxo. Após 48 horas de fluxo e exposição a 15 dines por centímetro quadrado de tensão de cisalhamento, as bordas celulares foram coradas com anticorpo anti-pcam e os núcleos com corante de ácido nucleico citoxina.Este método também permite obter amostras do PERFUSE oito em pontos de tempo predeterminados para a análise e/ou quantificação de metabólitos celulares secretados. Aqui é apresentado um exemplo da produção de nitrito durante um experimento de fluxo de 48 horas com EPCs suínos. Ao realizar este procedimento, é importante manter a esterilidade durante todo o processo.Além disso, é importante tomar as medidas necessárias para reduzir o número de bolhas de ar na câmara de fluxo antes do início do fluxo contínuo, pois elas podem destacar as células. Também recomendamos verificar cada conexão individual na câmara de fluxo e no circuito antes da perfusão para evitar vazamentos do PERFUSE eight durante um experimento. Esta câmara é projetada com anéis O integrados que permitem o perfeito alinhamento das placas superior e inferior e fornecem um selo à prova de vazamentos, sem necessidade de bombas de vácuo.Este recurso também garante uma altura constante da câmara entre experimentos e elimina a necessidade de juntas de borracha ou ajustes. Nossa câmara de fluxo utiliza lâminas de microscópio padronizadas. Assim, um grande número de células está disponível para experimentos adicionais.Por exemplo, o RNA e o DNA de células após o fluxo podem ser avaliados quanto à síntese proteica ou à expressão gênica. O nosso design de circuito permite a coleta de oito amostras para análise e quantificação de metabólitos celulares, como o nitrito, um metabólito oxidativo primário do óxido nítrico, que é secretado pelas células sob estresse por cisalhamento do fluido. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar nossa câmara de fluxo e o circuito de fluxo estéril para submeter células aderentes ao estresse por cisalhamento do fluido.

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Research

JoVE Journal

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Bioengenharia

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Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar (Vídeo) | JoVE Journal

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

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