Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

O objetivo geral deste artigo em vídeo é descrever uma técnica para submeter células aderentes a condições de fluxo laminar e avaliar a resposta a tensões de cisalhamento de fluido bem quantificáveis. Isso é feito primeiro montando o circuito de fluxo sem a câmara de fluxo. O circuito inclui o pulso do reservatório, amortecedor, tubulação dura, tubulação macia, torneiras de parada de quatro vias e adaptadores de isca conectados, bem como um filtro de ar.

O próximo passo é preencher o circuito com os oito profusos desejados, como meio celular em condições estéreis, e então ligar a bomba para encher o amortecedor de pulso e purgar a tubulação de ar. Isso é seguido pela inserção da corrediça assentada na célula na placa inferior da câmara de fluxo. A etapa final do procedimento é a montagem completa do circuito de fluxo com a câmara de fluxo alinhada.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o alinhamento de células progenitoras endoteliais marcadas com fluorescência sob exposição ao estresse de cisalhamento de fluido através da câmara transparente usando um microscópio fluorescente Para estudar o comportamento funcional das células. Muitas vezes é necessário imitar a fisiologia in vivo, submetendo as células ao estresse de cisalhamento do fluido. Projetamos uma câmara de fluxo de placas paralelas e um circuito de fluxo contínuo, que nos permitem estudar as células em condições de fluxo e observá-las através da câmara transparente.

Essa técnica pode servir como uma valiosa ferramenta de pesquisa para os campos da medicina e da engenharia. Nossa câmara de fluxo permite a visualização intermitente ou em tempo real de células sob fluxo usando microscópio vertical ou invertido. Além disso, o design do Dr.Ach Nick permite que os pesquisadores obtenham imagens de células em superfícies transparentes ou radiopacas usando lentes de microscópio padrão.

Além disso, pode ser uma ferramenta importante na pesquisa farmacológica para estudar o efeito de drogas nas células sob condições de fluxo. A visualização da configuração é crítica porque várias das etapas são difíceis de dominar apenas lendo um protocolo. Darei instruções passo a passo sobre como configurar a câmara de fluxo e o circuito de fluxo comumente usados no laboratório do Dr.Ock Next para montar o circuito de fluxo.

Comece conectando um segmento de 36 polegadas de tubo rígido a uma extremidade de um amortecedor de pulso na outra extremidade. Conecte um segmento de tubo macio de 18 polegadas. Coloque um adaptador de isca macho de um oitavo de polegada no final da seção de tubulação macia de 18 polegadas.

Conecte a isca macho a um adaptador de isca fêmea de um oitavo de polegada. Prenda a isca fêmea a um novo segmento de tubo macio de 18 polegadas. Faça três furos em uma tampa de copo de vidro de 250 mililitros.

Para encaixar a tubulação, insira um segmento de 1.5 polegada de tubulação macia em um orifício. Como uma saída de ar. Insira as extremidades livres do tubo duro e macio através dos outros dois orifícios da tampa na garrafa de vidro de 250 mililitros, que funcionará como um reservatório.

Certifique-se de que o tubo rígido atinja o fundo do reservatório. A manutenção da esterilidade durante toda a configuração do circuito é crucial para o sucesso deste procedimento. Portanto, todas as peças devem ser esterilizadas e você deve usar luvas estéreis por toda parte.

Além das peças montadas, essas peças devem ser esterilizadas. Uma câmara de fluxo completa, segmentos de três por duas polegadas de tubos macios, um macho e uma fêmea, um adaptador de isca de oitava polegada, quatro parafusos de cabeça chata de meia polegada, 6 5 16 polegadas, oito 30 segundos. Trilhos de polegada por polegada, parafusos de cabeça chata, um par de pinças, uma lâmina de vidro e duas toalhas esterilizadas a vapor.

Autoclavagem a 121 graus Celsius por 60 minutos. Coloque a câmara de fluxo do circuito de fluxo quatro por quatro torneiras de parada de quatro vias, uma a uma, pare a torneira e todas as partes esterilizadas neste campo estéril. Enquanto estiver usando luvas estéreis, conecte as duas torneiras de parada de quatro vias.

Coloque tampas nas portas de amostra abertas. Retire os adaptadores de isca macho e fêmea que prendem os dois segmentos de tubos macios do circuito de fluxo e insira as torneiras de parada conectadas. Conecte o tubo macio inserido no reservatório em uma seringa de 30 mililitros e remova o pistão da seringa.

Encha o frasco com 125 mililitros de meio EPC. Reconecte o tubo macio à torneira de parada. Coloque um filtro de seringa estéril na saída de ar.

Agora transfira o circuito de fluxo para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Prenda o tubo rígido na cabeça da bomba de rolo master flex indicada para uso com este tipo de tubo Palmer de carvão. Certifique-se de que a tubulação não se sobreponha às esteiras de montagem da bomba de rolos.

Marque a tubulação onde ela sai da cabeça da bomba em ambos os lados com uma caneta marcadora. Depois de garantir que todas as torneiras de parada estejam fechadas em direção às portas de amostra e abertas ao longo do circuito de fluxo, ligue a bomba. Verifique a direção do fluxo.

O PERFUSE oito deve se mover do reservatório de vidro através do tubo rígido para o pulso dampener. Para a montagem da câmara de fluxo, use luvas estéreis para conectar um segmento de tubo macio de duas polegadas a um adaptador de isca fêmea de um oitavo de polegada. Conecte outro segmento de tubo macio de duas polegadas a um adaptador de isca macho de um oitavo de polegada.

Conecte o tubo macio de duas polegadas com adaptador de isca fêmea à porta de entrada e o tubo macio de duas polegadas com adaptador de isca macho à porta de saída. Anexe torneiras de parada de quatro vias a ambos os adaptadores de isca. Conecte a peça de tubo macio restante de duas polegadas ao conector da porta lateral que sai do coletor de bolhas e conecte uma torneira de parada unidirecional usando uma pinça estéril.

Remova a lâmina semeada de células do recipiente de cultura de células e coloque-a no recesso na placa inferior da câmara de fluxo. Certifique-se de que a lâmina seja colocada com o lado da célula voltado para cima usando uma seringa ou pipeta, coloque 10 mililitros de meio EPC quente sobre a lâmina assentada na célula. Deixe o meio cobrir a corrediça na câmara de fluxo, mas não derrame o meio sobre o O-ring na placa inferior.

Coloque a placa superior da câmara de fluxo na placa inferior, alinhando os orifícios dos parafusos. Mantenha as duas placas paralelas para não introduzir bolhas de ar nas placas de rosca da câmara. Junto. Usando uma chave de fenda automática operada por bateria de ar o coletor de bolhas de entrada abrindo a torneira de parada unidirecional presa à porta do coletor de bolhas do lado de entrada.

Use uma seringa de 10 mililitros para lavar suavemente o tubo de entrada com meio EPC e, em seguida, feche esta torneira de parada e tampe-a. Agora areje o canal da câmara abrindo a torneira de parada de quatro vias da porta de saída e lavando suavemente o meio EPC através da câmara de fluxo. Novamente, usando uma seringa de 10 mililitros, cubra todas as conexões da torneira de parada de quatro vias e feche-as.

Transfira a câmara de fluxo para a incubadora umidificada com o circuito de fluxo montado. Pause a bomba do circuito de fluxo e feche o circuito de fluxo. Pare as torneiras na direção do fluxo para evitar vazamentos.

Conecte a câmara de fluxo ao circuito de fluxo Depois que a câmara de fluxo for conectada ao circuito de fluxo, abra as torneiras de parada na direção do fluxo. Retome a bomba de fluxo e certifique-se de que o PERFUSE oito flua na direção correta. Ajuste a taxa de fluxo para a tensão absoluta desejada.

Durante o experimento de fluxo, a câmara de fluxo pode ser removida do circuito para obter imagens das células por meio de microscopia de luz ou fluorescente. Para fazer isso, desconecte a câmara de fluxo do circuito de fluxo na torneira de parada para interromper as conexões da torneira. Para coletar perfundir oito amostras para análise.

Primeiro, pause a bomba, feche a torneira de parada localizada mais próxima do pulso dampener. Remova sua tampa protetora, colocando-a de cabeça para baixo para garantir que não esteja contaminada. Insira uma pequena seringa na porta de amostra.

Feche a torneira de parada na direção da câmara de fluxo, mantendo a porta de amostra e o circuito na direção do pulso dampener aberto. Retire a quantidade desejada de sample do circuito, feche a torneira em direção à porta de sample antes de remover a seringa. Armazene a amostra abundante oito em um frasco rotulado e congele a 80 graus Celsius negativos.

Volte a tampar a porta de amostra e certifique-se de que todas as torneiras estão abertas antes de iniciar o fluxo. Usando este método, as células progenitoras endoteliais derivadas do sangue humano podem ser semeadas em lâminas de titânio em 15 minutos e aderir sob forças de cisalhamento fisiológicas. Conforme mostrado nesta figura, os EPCs se espalham sob a influência do fluxo de cerca de 210 mícrons quadrados imediatamente após a semeadura para cerca de 657 mícrons quadrados após três horas e cerca de 1.152 mícrons quadrados após 48 horas de tensão de cisalhamento do fluido de 15 dines por centímetro quadrado.

Esta imagem de microscópio de luz ilustra a orientação aleatória das EPCs humanas. Após um período estático de seis horas após três horas de fluxo a 100 dines por centímetro quadrado, as células se espalharam, mas permanecem em uma orientação aleatória. Após 48 horas de tensão de cisalhamento do fluido a 100 dines por centímetro quadrado, os EPCs são alinhados e orientados na direção do fluxo.

Aqui, as EPCs foram marcadas com CTO e os núcleos das células corados com herx para morrer após o fluxo. Para comparação, esta imagem mostra EPCs suínos em lâminas de titânio alinhadas com a direção do fluxo. Após 48 horas de fluxo e 15 dines por centímetro quadrado de exposição à tensão de cisalhamento, as bordas celulares foram coradas com coloração anti-pcam e os núcleos com coloração de ácido nucleico de citoxina.

Este método também permite a obtenção de amostras do PERFUSE eight em momentos predeterminados para a análise e/ou quantificação de metabólitos de células secretadas. Aqui é mostrado um exemplo da produção de nitrito durante um experimento de fluxo de 48 horas com EPCs suínos. Ao tentar este procedimento, é importante manter a esterilidade por toda parte.

Além disso, é importante tomar as medidas necessárias para reduzir o número de bolhas de ar na câmara de fluxo antes do início do fluxo contínuo, pois elas podem arrancar as células. Também recomendamos verificar cada conexão na câmara de fluxo e no circuito antes da profusão para evitar vazamento de PERFUSE oito durante um experimento. Esta câmara é projetada com anéis de vedação embutidos que permitem a oposição completa das placas superior e inferior e fornecem uma vedação à prova de vazamentos sem a necessidade de bombas de vácuo.

Esse recurso também garante uma altura constante da câmara entre os experimentos e elimina a necessidade de juntas ou ajustes de borracha. Nossa câmara de fluxo emprega lâminas de microscópio padronizadas. Portanto, um grande número de células está disponível para novos experimentos.

Por exemplo, RNA e DNA de células após o fluxo podem ser avaliados quanto à síntese de proteínas ou expressão gênica. Nosso projeto de circuito permite a coleta de oito amostras perfundidas para análise e quantificação de metabólitos celulares, como nitrito, um metabólito oxidativo primário do óxido nítrico, que é secretado pelas células sob estresse de cisalhamento de fluido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar nossa câmara de fluxo e circuito de fluxo estéril para submeter as células de aderência ao estresse de cisalhamento do fluido.