Name: Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a usar o sistema de cultura celular rotacional para criar agregados 3D de células trofoblásticas humanas. Este método restaura características fisiológicas e melhora a expressão de marcadores de diferenciação em comparação com culturas 2D tradicionais.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health EUA conceder NIH / NICHD # HD051998 (para CAM).

1. Preparação de colágeno Bead <ol><li> Antes de TEVs carregamento para 3-D de cultura de células, é preciso preparar as contas Cytodex-3 microcarregador: <ol><li> Pesar a quantidade adequada de Cytodex-3 contas necessárias para o experimento. Este protocolo é adaptado para o navio RCCs 10ml, em que 0,05 g de contas são necessários. Para que um navio RCCs 50ml, escala em conformidade. Em um tubo de 50 ml autoclavável cônica, misturar 250 mg Cytodex-3 contas com 12 ml de fosfato tamponada Dulbecco (DPBS). Este montante é suficiente para 5 navios CCRs. </li></ol></li><li> Assegurar um volume adequado está presente no tubo cônico, como o processo de autoclave irá resultar em evaporação. Vagamente tampa do tubo e autoclave por 10 minutos a 110 ° C. </li><li> Remover o tubo cônico na conclusão do ciclo de autoclave e deixar a solução Cytodex-3 talão para esfriar. </li><li> Após o tubo cônico esfriou a temperatura ambiente, use uma técnica estéril para trazer o volume total de 12.5mL usando 1X DPBS. </li><li> Tampa e guarde o preparado Cytodex-3 contas à temperatura ambiente. Permitir que as contas preparados para inchar e esfriar a temperatura ambiente antes do uso. A preparação acima de Cytodex-3 contas irá fornecer para cinco navios 10ml CCRs. Temos observado que o armazenamento prolongado de Cytodex-3 contas à temperatura ambiente irá resultar em desempenho reduzido, como o colágeno vai desestabilizar após aproximadamente um mês. Cytodex-3 contas variam em tamanho 133-215 mM. </li></ol> 2. Preparação da mídia <ol><li> Prepare 1L de CCRs otimizado GTSF media-2 (adaptado de 22), que consiste em 40% MEM alfa, além de suplementos e 60% ​​L-15 Leibovitz de mídia (adaptado de 22). Primeiro, prepare 400mL no volume total de alfa MEM suplementado com: Bicarbonato de sódio 21.2mm Peptona 0,06% Frutose 0,7 mm Galactose 1,4 mm Glucose 5.6mm HEPES 1% 1% L-glutamina 0,5% ITS F 10%BS </li><li> Para preparar uma solução estoque de ITS, dissolver em 5 mL estéreis acidificados H 2 O preparado por adição de ácido acético glacial (cerca de 0,05 ml). Agite para dissolver, siga com água estéril 45ml. </li><li> Pesar o suficiente L-15 em pó Leibovitz para 600ml de meio de dissolvendo em cultura de tecidos de grau H 2 O. </li><li> Trazer o volume total de meio de cultura celular para 1L com L-15 de médio Leibovitz. Filtro-esterilizar e armazenar a 4 ° C no escuro. Adicione 1% Penicilina-estreptomicina individualmente para cada alíquota de meio utilizado. </li><li> Muitas formulações de outros meios de mídia GTSF-2 ter sido testado com sucesso nos CCRs. Laboratórios indivíduo deve decidir por si quais médio é o ideal para o experimento que está sendo executada. </li></ol> 3. Células e Incubação Bead <ol><li> Propagar a TEVs para ~ 80% confluência, trypsinize e contar com práticas aceitas cultura de células. </li><li> Suspender 1x10 6 TEVs em 4mL de mornoed mídia. </li><li> Misture delicadamente preparado Cytodex-3 esferas. Usando técnicas estéreis, retire 2,5 ml de contas preparada com a ponta de largura, 10 ml sorológicos pipeta e transferir para um tubo cônico 15mL não utilizados. Note-se que pode haver uma pequena perda de contas que atribuem à pipeta. </li><li> Permitir que o Cytodex-3 contas para resolver sobre o fundo do tubo. Após a sedimentação, use uma pipeta para remover a camada superior da DPBS sem perturbar as contas Cytodex-3. </li><li> Misture a 1x10 6 TEVs preparadas em media com o preparado Cytodex-3 esferas. </li><li> Incubar a mistura de células-grânulo em temperatura ambiente por 30 min. Periodicamente, misture delicadamente. Incubar durante 30 min ainda a 37 ° C e 5% CO 2. Periodicamente, misture delicadamente. </li></ol> 4. Carregando o RWV <ol><li> Em uma câmara de fluxo laminar, remover um RCCs 10 ml da embalagem e colocá-lo em uma placa de cultura estéril, 6-bem para a estabilidade. Consulte a Figura 1 para ver um diagrama do rótulo do RCCS. </li><li> Remova a tampa do porta grande. </li><li> Trazer o volume total da mistura de incubação de células-talão até 10 ml com a mídia aquecido. </li><li> Carregar o celular / mistura-grânulo no RCCs através da porta grande. Os CCRs deve ser inclinado em um ângulo de 45 ° (até grande porto) ao carregar para ajudar na remoção de bolhas de ar em potencial. Evitar acúmulo de pressão positiva através do preenchimento da embarcação lenta e progressivamente. </li><li> Substituir a tampa do porta grande. </li><li> Remover os pistões do seringas de 3 ml e coloque as seringas vazias para os portos de pequeno porte. Adicionar 1-3 mL de mídia para cada seringa. Abrir lentamente as duas válvulas. Substitua os pistões seringa na seringas suavemente. Adicionar mídia a partir de uma seringa até todas as bolhas são removidos do interior da câmara. </li><li> Pegue o CCRs e bata suavemente de lado enquanto gira-lo na frente de você para verificar se há bolhas. Se houver bolhas, você deve levá-los para fora da câmara, como bolhas de ar irá interferir com a formação of agregados celulares e introduzir forças de cisalhamento. Remova as bolhas girando o RCCs até que as bolhas estão sob o pequeno porto. Depois, empurre para baixo sobre a seringa no lado oposto à força as bolhas na porta e fora da câmara. </li><li> Fechar uma porta lateral. Gentilmente empurre para baixo o pistão outra seringa para introduzir uma pequena quantidade de pressão positiva dentro do vaso, o que impede a formação de bolhas. Feche a válvula segundo. </li><li> Carregar os CCRs para o rotor. Iniciar a rotação em 19rpm a 37 ° C incubadora de CO 2. </li></ol> 5. Alterando a mídia <ol><li> Troque a mídia todos os dias durante os primeiros três dias, então todos os dias depois. </li><li> Desligue o rotor e remova o CCRs. Puxe os pistões para criar alguma sucção, retire as seringas de cada pequeno porto e coloque o CCRs em um ângulo de modo que as contas resolver oposto do grande porto. </li><li> Após as contas têm tudo acertado, abra uma das válvulas pequenas epermitir que os meios de comunicação a fluir para fora do CCRs e em um recipiente de resíduos. Retire 2 / 3 dos meios de comunicação desta forma. Certifique-se de não perturbar as contas e para não descartar qualquer agregados. </li><li> Feche a válvula de pequenas e abrir a porta grande. Adicionar mídia de volta para o RCCs através da porta grande. Substituir a tampa do porta grande. </li><li> Repita os passos de 4,6-4,9. </li><li> Como os agregados aumentam de tamanho, você precisa aumentar a velocidade de rotação para mantê-los em suspensão em todos os momentos, de preferência em um padrão circulatório pequeno na velocidade ideal. Geral, aumentar a velocidade entre 0,3-0,7 rpm após cada mamada, uma vez agregados começar a crescer visivelmente. </li></ol> 6. Coleta de células propagadas <ol><li> Remover o CCRs do rotor. Remove as seringas de cada pequeno porto e coloque o CCRs em um ângulo de modo que as contas poderá resolver oposto do grande porto. </li><li> Após as contas têm tudo acertado, abra uma das válvulas de pequenos e permitir que os meios de comunicação a fluir para forados CCRs e em um recipiente de resíduos. Retire 1 / 3 dos meios de comunicação desta forma. </li><li> Feche a válvula de pequenas e abrir a porta grande. Agite suavemente o navio para dispersar os agregados na solução. Mistura líquida vazia em um tubo cônico estéril 50ml. Permitir que os agregados coletados para se estabelecer no tubo cônico antes de usar o sobrenadante para lavar o vaso cultura para maximizar a recuperação de agregados. Os agregados podem ser usados ​​para ensaios de downstream imediatamente, como a citometria de fluxo, ensaios de invasão, imunofluorescência e outros. </li></ol> 7. Resultados representante Um exemplo de como as células-EVT (SGHPL-4 linha de células do trofoblasto) cultivadas no CCRs em Cytodex-3 contas é mostrado na Figura 2. A linhagem celular EVT-like exibe projeções estende para longe do principal grupo e anexando a clusters vizinhos. Muitas das contas são completamente cobertas com células propagação. Uma vez retirado do CCRs e plated em uma matriz extracelular, a EVT-3-D como células cultivadas de forma agressiva invadir e / ou migrar (Figura 3). RT-PCR dados confirmam o aumento da expressão de MMPs visto em 3-D agregados ao contrário de monocamadas de células tradicionais de cultura (Figura 4). Curiosamente, os genes não associados com a invasão também são upregulated na CCRs (Tabela 1) e pode ajudar no delineamento de áreas tais como interações imune com células invadindo trofoblasto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Representação dos desenhos animados do Sistema de Rotação de Cultura Celular (CCRs). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Micrografia de contraste de fase de um agregado representante após 5 dias de crescimento em um CCRs. Setas indicam células invasoras e * denota as contas Cytodex-3 microcarregador. <imgalt src='"files/ftp_upload/3367/3367fig3.jpg'></imgalt> Agregados figura 3. RCCs Grown foram incorporados em géis de fibrina. Invasão através do gel de fibrina foi observada já em (A) 24 horas após a incorporação de fibrina e (B) continuou até 48 horas. Setas indicam células invasoras e * denota as contas Cytodex-3 microcarregador (Adaptado, com permissão, de Ref. 7). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Zymogram gelatina comparativo de monocamada e CCRs propagada SGHPL-4 EVT células semelhantes. Formas pró-ativa e de MMP-2 e MMP-9 foram secretado pelas células trofoblásticas cultivadas CCRs (Adaptado, com permissão, de Ref. 7). <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Resumo dos resultados de microarray SGHPL-4 células cultivadas em CCRs (Adaptado, com permissão, de Ref. 7). <ol class="lalpha"><li dobre indu nos agregados foi calculado da seguinte forma: normalizado gene valor monlayer.><li> Indica genes que estavam abaixo do limite de detecção em monocamadas. </li></ol>

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</ol>

Não temos nada a revelar.

A técnica de cultura aqui apresentada fornece aos investigadores altamente invasivo EVT células semelhantes. Ele já foi reconhecido que a perda de diferenciação ocorre em monocamadas devido à inibição da resposta celular a agentes químicos e sinais moleculares em três dimensões (superfícies celulares apical, basal e lateral) 10,13. Esta técnica reflete características observou in utero invadir células EVT. Como o procedimento imita convencionais monocamada tecido cinética de tempo da cultura, mas for...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Contas Cytodex microcarregador </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de Cultura rotativa Cell (CCRs) </td><td> Synthecon </td><td> RCCs-D </td><td> Inclui rotor base de fornecimento de alimentação, 4 unidades descartáveis ​​CCRs </td></tr><tr><td> Unidades RCCs descartáveis </td><td> Synthecon </td><td> Fale Synthecon </td><td></td></tr><tr><td> 3ml da seringa Luer-Lock </td><td> BD </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml de grande ponta de pipeta sorológica </td><td> BD </td><td> 357504 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Alpha </td><td> Invitrogen </td><td> 12561-072 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 de médio pó, </td><td> Invitrogen </td><td> 41300-039 </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O, de endotoxina livre </td><td> Pescador </td><td> MT-25-055-CM </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-7795 </td><td></td></tr><tr><td> Peptona </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1420-100 </td><td></td></tr><tr><td> Frutose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> Galactose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5388-100 </td><td></td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Insulina-transferrina-selenito de sódio (ITS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

sistemas célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas humanos como um modelo

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

O campo de pesquisa trofoblasto humano ajuda na compreensão do ambiente complexo estabelecido durante placentação. Devido à natureza destes estudos, humanos em experimentação in vivo é impossível. A combinação de culturas primárias, as culturas de explante e linhas de células do trofoblasto um auxiliar para a compreensão de invasão da parede uterina 2 e remodelação das artérias uterinas espiral 3,4 por células do trofoblasto extravilosas (TEVs), que é necessário para o estabelecimento de sucesso da gravidez. Apesar da riqueza de conhecimentos provenientes de tais modelos, aceita-se que em modelos de células in vitro utilizando linhas cultura EVT-como célula de exibição alterado propriedades celular quando comparados com os seus homólogos em 5,6 vivo. Células cultivadas em sistema de rodízio de cultura de células (CCRs) exibir as propriedades morfológicas, fenotípicas e funcionais de linhas de EVT-como célula que mais perto imitar diferenciar em uTEVs Tero, com aumento da expressão de genes de mediação invasão (por exemplo metaloproteinases de matriz (MMPs)) e diferenciação do trofoblasto 7,8,9. O Hospital Saint Georges de células placentária Linha-4 (SGHPL-4) (gentilmente doado pelo Dr. Guy Whitley e Judith Dr. Cartwright) é uma linha de células EVT-like que foi usado para testes no CCRs. O design do navio cultura RCCs é baseado no princípio de que órgãos e tecidos em função de uma imagem tridimensional do ambiente (3-D). Devido às condições de cultura dinâmica no reservatório, incluindo as condições de cisalhamento fisiologicamente relevantes, as células cultivadas em três dimensões formam agregados com base em afinidades naturais celular e se diferenciar em tecido organotípicas-like assembléias 10,11,12. A manutenção de uma órbita de fluido proporciona um baixo cisalhamento, o ambiente de turbulência de baixa semelhante às condições encontradas in vivo. Sedimentação das células cultivadas for anulada, ajustando a rotaçãovelocidade do CCRs para assegurar uma constante queda livre de células. Troca de gases ocorre através de uma membrana permeável hidrofóbica localizado na parte traseira do biorreator. Como seus pais tecido in vivo, CCRs de produção de células são capazes de responder a química molecular e gradientes em três dimensões (ou seja, suas superfícies apical, basal e lateral), porque eles são cultivadas na superfície dos grânulos microcarregador poroso. Quando cultivada como bidimensional monocamadas em superfícies impermeáveis, como o plástico, as células são privados dessa comunicação importante em sua superfície basal. Conseqüentemente, as restrições espaciais impostas pelo ambiente afetam profundamente sentido como células e decodificar sinais do microambiente em torno, o que implica um papel importante para o meio 3-D 13. Temos usado a CCRs para engenheiro biologicamente significativas modelos 3-D de vários tecidos epiteliais humanas 7,14,15,16. De fato, muitos relatórios anteriores demtrada que as células cultivadas em CCRs pode assumir fenótipos fisiologicamente relevantes que não foram possíveis com outros modelos 10,17-21. Em resumo, a cultura na RCCs representa uma tarefa fácil, reprodutível, plataforma de alto rendimento que proporciona um grande número de células diferenciadas que são passíveis de uma variedade de manipulações experimentais. No protocolo a seguir, usando TEVs como exemplo, que descrevem claramente os passos necessários para as células de forma tridimensional de cultura aderente na CCRs.

Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

O campo da pesquisa de trofoblastos humanos auxilia na compreensão do ambiente complexo estabelecido durante a placentação. Devido à natureza desses...

Este procedimento utiliza um sistema de cultivo celular tridimensional para simular a cinética celular in vivo. Comece incubando as células com microesferas revestidas com colágeno ENC. Em seguida, carregue as células e microesferas em um sistema rotativo de cultivo celular e propague agregados celulares tridimensionais em um ambiente com baixo cisalhamento e baixa turbulência.Por fim, colete as células para uso em aplicações posteriores em comparação com a expressão gênica e a diferenciação celular de células cultivadas em uma monocamada típica. Os cultivos 3D resultantes demonstram cinética e comportamento celulares que se assemelham de perto ao observado in vivo.Utilizamos o RCCS para desenvolver modelos tridimensionais biologicamente significativos de diversos tecidos epiteliais humanos. A Dra. Jessica Warner, ex-aluna de pós-graduação no laboratório da minha colaboradora, Dra. Sydney Morris, demonstrará agora este procedimento com células EVT em um tubo cônico de 50 mililitros. Autoclave 250 miligramas de microcargas, esferas Cytodex Três, em 12 mililitros de DPBS. Deixe as esferas preparadas incharem e esfriarem até a temperatura ambiente.Em seguida, em condições estéreis, co

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de blastocistos mouse ea derivação de células-tronco de blastocistos trofoblasto. Descrevemos também condições para a manutenção da propriedade de célula-tronco, bem como a indução de diferenciação em cultura.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

Este manuscrito apresenta um modelo in vitro único de células citotrofoblásticas vilosas humanas imunopurificadas cultivadas sob hipóxia/reoxigenação. Este modelo é adequado para estudar os efeitos protetores de tratamentos promissores, como a melatonina, nas complicações da gravidez associadas ao aumento do estresse oxidativo e à alteração da função placentária.

Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Apresentado aqui é um protocolo para amostragem de tecido placentário humano das vilosidades seguido pelo isolamento de cytotrophoblasts para cultura de células primárias. Tratamento de trophoblasts com TNFa recapitula a inflamação no ambiente intra-uterino obeso e facilita a descoberta de alvos moleculares regulada pela inflamação na placenta com obesidade materna.

Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

O protocolo mostra um novo modelo experimental in vitro que pode recapitular a biologia de dois tipos de linhagens celulares aderentes com um andaime impresso em tridimensional (3D). A construção deste modelo e os procedimentos operacionais, desde a preparação e cultura celular até a análise e avaliação, são descritos.

Modelo de co-cultura usando dois tipos de linhagens celulares aderentes

Esse protocolo permite a purificação, caracterização e cultivo de trofoblastos extravilosos primários HLA-G+ (EVT) a partir da decídua basal e da membrana coriônica das placentas humanas a termo. Culturas primárias de EVT mantêm a viabilidade por 96 horas, permitindo co-cultura com células imunes maternas comparadas por amostra e subsequente análise citométrica e molecular de fluxo de suas interações.

Purificação de Trofoblastos Extravillosos HLA-G+ de Tecidos Placentários Humanos para Fenotipagem e Análise Funcional

Aprenda a usar o sistema de cultura celular rotacional para criar agregados 3D de células trofoblásticas humanas. Este método restaura características fisiológicas e melhora a expressão de marcadores de diferenciação em comparação com culturas 2D tradicionais.

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