Name: Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a mapear circuitos neurais em 3D usando traçadores WGA-Alexa em camundongos. Este protocolo permite visualizar projeções topográficas no cerebelo, córtex e medula com alta resolução e transporte rápido bidirecional.

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Este trabalho foi financiado pelo investigador novas start-up fundos de Albert Einstein College of Medicine da Yeshiva University de RVS.

<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos os detalhes cirúrgicos e técnicos necessários para o sucesso rastreamento axonal e dendrite usando uma abordagem baseada em romance fluorescentes para rapidamente rotulagem projeções neurais no desenvolvimento e camundongos adultos. Utilizando-WGA Alexa mostramos como traçadores e marcadores podem ser usados ​​para analisar padrões topografia de circuito em alta resolução e em três dimensões. Traçadores muitos estão disponíveis para rastrear circuitos neuronais incluindo cóle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipamento / reagentes </td><td> Modelo / número Catálogo </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Bead esterilizador </td><td> Modelo Steri 250 Cat. # 18000-45 </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td></tr><tr><td> Cauterizador </td><td> Gato. # 18000-00 </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td></tr><tr><td> Vidro borosilicato capilares </td><td> Gato. # 300056 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Vidro duplo estágio Micropipeta Puller </td><td> Modelo PC-001-10 </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> Seringa micrométrica </td><td> Gato. # GS-1100 </td><td> Gilmont Instruments </td></tr><tr><td> Instrumento estereotáxica Pequenos Animais </td><td> Modelo 940-A </td><td> Instrumentação Kopf </td></tr><tr><td> Manipulator eletrodo </td><td> Modelo 960 </td><td> Instrumentação Kopf </td></tr><tr><td> Vetcare câmara </td><td> Gato. #340508 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Almofada de aquecimento </td><td> Gato. # 341241 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Leica DFC360 FX câmera </td><td> DFC360 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica câmera DFC490 </td><td> DFC490 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DM5500 microscópio </td><td> DM5500 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX câmera </td><td> DFC3000 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscópio </td><td> MZ16 FA </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Cy3 Filtro </td><td> Modelo # 11600231 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> FITC Filtro </td><td> Modelo # 11513880 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> A4 DAPI / filtro UV </td><td> Modelo # 11504162 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 488 conjugado </td><td> Gato. # W11261 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Trigo germ aglutinina, Alexa Fluor 555 conjugado </td><td> Gato. # W32464 </td><td> Invitrogen </td></tr></tbody></table>

revelando topografia circuito neural em multi-color

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Circuitos neurais funcionais estão organizados em mapas topográficos. Para visualizar a arquitetura circuito complexo que nós desenvolvemos uma abordagem para a fiabilidade rótulo o padrão global de múltiplas projeções topográficos. O cerebelo é um modelo ideal para estudar o arranjo ordenado dos circuitos neurais. Por exemplo, a organização compartimental de espinocerebelar fibras musgosas provou ser um sistema indispensável para o estudo de padronização de fibras musgosas. Recentemente, mostrou que aglutinina de gérmen de trigo (WGA), conjugada com Alexa 555 e 488 podem ser usados ​​para rastreamento espinocerebelar projeções de fibras musgosas no desenvolvimento e camundongos adultos (Reeber et al. 2011). Encontramos três principais propriedades que tornam as ferramentas WGA-Alexa traçadores desejável para rotulagem projeções neural. Primeiro, fluoróforos Alexa são intensas e seu brilho permite imagens wholemount diretamente após rastreamento. Segundo, WGA-Alexa traçadores rótulo toda a trajetória de desenvolvimento neural e adultos Projections. Terceiro, WGA-Alexa traçadores são rapidamente transportados nas direções retrógrada e anterógrada. Aqui, descrevemos em detalhes como preparar os marcadores e outras ferramentas necessárias, como executar a cirurgia para rastreamento espinocerebelar ea melhor forma de projeções de imagem traçada em três dimensões. Em resumo, nós fornecemos um protocolo passo a passo de rastreamento que vai ser útil para decifrar a organização e conectividade de mapas funcionais não só no cerebelo, mas também no córtex, tronco cerebral e medula espinhal.

Nós fornecemos um guia prático para entregar traçadores<em&gt; In vivo</em&gt; E usar a via espinocerebelar como um sistema modelo para demonstrar passos essenciais para a análise do circuito neuronal sucesso em camundongos. Descrevemos em detalhe o nosso protocolo versátil rastreamento que explora aglutinina de gérmen de trigo (WGA), conjugada com fluoróforos Alexa.

Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color

Os circuitos neurais são organizados em mapas topográficos funcionais. A fim de visualizar a arquitetura complexa dos circuitos, desenvolvemos uma abordagem para ...

Este procedimento descreve um protocolo versátil de rastreamento in vivo que utiliza glutenina de germe de trigo conjugada a fluoróforos Alexa para rastrear circuitos neuronais. Primeiro, é feita uma incisão na região torácica inferior e na região lombar superior, e a fáscia e os músculos espinhais superficiais são cortados. O segundo passo consiste em realizar uma laminectomia dorsal.Em seguida, o microeletrodo é preparado e fixado ao micromanipulador. Depois, realiza-se a injeção por pressão de traçadores neurais na medula espinhal. O passo final deste procedimento é fornecer os devidos cuidados pós-cirúrgicos durante a recuperação e garantir tempo suficiente para que os traçadores sejam transportados por todo o trajeto alvo.Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram a organização e conectividade de mapas topográficos no córtex cerebelar, tronco encefálico e medula espinhal por meio de microscopia de imunofluorescência. A principal vantagem deste traçador em relação a traçadores existentes, como BDA ou W-G-A-H-R-P, é que os traçadores WGA Alexa são suficientemente brilhantes para permitir a imagem em montagem total diretamente após o rastreamento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência de sistemas, como qual é a lógica subjacente ao padrão global de múltiplas projeções topográficas dentro e entre os sistemas corticais, cerebelar, tronco encefálico e medular antes do início do procedimento.Certifique-se de que todas as manipulações estejam em conformidade com as diretrizes do iacuc, que um campo estéril esteja disponível para a cirurgia e que todos os instrumentos a serem utilizados tenham sido esterilizados. Técnicas cirúrgicas estéreis devem ser utilizadas durante toda a cirurgia após a administração de um anestésico aprovado ao animal; certifique-se de que um plano anestésico adequado tenha sido alcançado realizando um teste de pressão nos dedos dos pés. O reflexo plantar deve estar ausente assim que o animal estiver completamente anestesiado.Apare a pelagem da região a ser operada com uma tesoura elétrica. Em seguida, posicione o animal com a face dorsal voltada para cima sobre uma gaze estéril, utilizando um padrão circular de dentro para fora. Limpe a região aparada com dois conjuntos de lenços umedecidos com álcool, seguidos por Betadine a 70% em álcool.Em seguida, novamente com lenços de álcool, delimite claramente o campo cirúrgico colocando uma compressa estéril com um pequeno orifício cortado sobre o animal após a correta preparação do animal. Dessa forma, prossiga para a cirurgia e mantenha uma técnica cirúrgica estéril adequada. Levante a pele usando pinça e faça uma incisão com tesoura na linha média diretamente acima da região torácica inferior e lombar superior.Corte a fáscia e os músculos espinhais superficiais, se necessário, e estanche qualquer sangramento cauterizando os vasos sanguíneos. Em seguida, identifique o ponto médio entre o processo articular e o processo espinhal dorsal e corte a lâmina aqui em ambos os lados da coluna vertebral. A seguir, realize uma laminectomia dorsal removendo os processos espinhosos de um ou dois segmentos da medula espinhal torácica inferior e lombar superior.Usando uma seringa micrométrica, encha uma pipeta de vidro com o traçador. Em seguida, aperte a microeletrodo de vidro no lugar em um micromanipulador. Depois, encha a agulha com os reagentes.Insira a pipeta reunida entre 0,1 e 0,5 milímetros na região torácica inferior e lombar superior da medula espinhal. Na metade do caminho entre a linha média e a borda lateral da medula espinhal, injete por pressão aproximadamente 0,5 microlitros de uma solução a 2% de conjugado de aglutinina de trigo LOR, aglutinina de gérmen de trigo, conjugado de peroxidase de rábano, ou 10% de dextrana aminobiotinilada em PBS suplementado com 0,5% de verde rápido, ao longo de um período de três a cinco minutos. Se o traçador não sair facilmente da pipeta, recolha lentamente a ponta para criar um pequeno bolsão no tecido.Em seguida, tente injetar novamente após a conclusão da microinjeção. Feche suavemente a pele com clipes cirúrgicos e cola tecidual. Em seguida, coloque o animal em uma câmara de recuperação sobre uma placa aquecida.Monitore a frequência respiratória e verifique os sinais de que o animal está tentando se mover. Após o animal se recuperar da anestesia, devolva-o à gaiola de origem e forneça água e alimento ad libitum, bem como analgésicos conforme necessário. Verifique rotineiramente sinais de dor, desconforto ou infecção, e de alimentação e hidratação adequadas; os animais injetados com glúten de germe de trigo e traçadores conjugados são sacrificados.24 horas após a microinjeção. O BDA normalmente exige tempos de sobrevida mais longos para rastrear completamente as projeções neurais e, portanto, para o mapeamento completo das projeções espinocerebelares. Esses animais são sacrificados após aproximadamente 11 dias.Tracers de glutenina de germe de trigo foram injetados na medula espinhal torácica inferior e lombar superior. Este esquema ilustra a origem e a terminação da glutenina de germe de trigo. Neurônios espinocerebelares marcados com Alexa 555.Esta figura mostra o local da injeção após a administração de trigo germe aglutinina Alexa 5 55 na região torácica inferior e lombar superior da medula espinhal de adulto. Esta imagem de montagem inteira mostra os lobos anteriores após a injeção de trigo. Gemma Glutenina.Alexa 555 no território torácico inferior e lombar superior da medula espinhal. Os lóbulos são indicados por algarismos romanos. Aqui observamos que o traçado anterógrado com Alexa 555 da gluteína de trigo revela faixas definidas de fibras musgosas, conforme visto nesta secção coronal do tecido.Este esquema do cerebelo do camundongo resume o padrão geral do cerebelo espinhal. Bandas de fibras musgosas marcadas com wheatgermagluten na Alexa 555 foram injetadas no lado direito da medula espinhal lombar e wheatgermagluten na Alexa 488 no mesmo segmento do lado esquerdo, conforme observado em uma seção coronal de tecido cortada através dos LOEs posteriores.Os dois traçadores Alexa de aglutinina Weger foram transportados até o cerebelo e rotularam com sucesso subconjuntos distintos de terminais de fibras musgosas, principalmente na camada de células granulosas, identificada como CLG. Os traçadores Alexa de aglutinina Weger podem ser usados em combinação com imunohistoquímica e histologia para marcação tripla de neurônios e projeções. Aqui, a aglutinina Weger Alexa 555 é depositada nos terminais das fibras musgosas no lábio três. Esta imagem com maior aumento da região delimitada ilustra a marcação nítida dos terminais das fibras musgosas.Esta imagem da coloração com zeína dois revela uma série de faixas de células do biquíni em Lole três. Esta imagem com maior aumento da região delimitada ilustra a marcação nítida das células do biquíni na camada de células do biquíni e na camada molecular. Aqui, a coloração com DPI revela núcleos neuronais e gliais.Esta imagem com maior aumento da região destacada em caixa ilustra uma marcação intensa nas camadas ricas em núcleos: camada de células granulares e camada de células bikini, e uma marcação menos densa na camada molecular. Aqui emerge uma imagem que mostra uma tripla marcação por Wheatgerm Agglutinin, Alexa 5 55 serin dois e DPI, evidenciando as faixas de aferências, as faixas de células bikini e a arquitetura citológica geral. Finalmente, esta imagem com maior aumento da região em caixa ilustra claramente o poder desta técnica em revelar a arquitetura citológica das estruturas cerebrais.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 20 minutos por animal, se feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de imaginar o tecido imediatamente após o corte. Embora a imagens nos dois dias seguintes ao corte ainda permita imaginar com sucesso fibras e terminais marcados após este procedimento.Outros métodos, como o rastreamento genético de linhagem, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como, quais são os padrões de projeção e os padrões de terminação de populações de células definidas geneticamente?

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A questão fundamental em nossa compreensão do circuito cortical é como as redes em diferentes camadas corticais codificar a informação sensorial. Aqui, descrevemos técnicas eletrofisiológicas utilizando eletrodos de contato multi-laminar para gravar um único unidades e potenciais de campo locais e análises presentes para identificar camadas cortical.

Examinando Processamento Rede Local usando contato Multi-Gravação Eletrodo Laminar

Este artigo apresenta uma abordagem que combina a fotostimulação com varredura a laser e gravações em célula inteira em camundongos transgênicos que expressam GFP em populações limitadas de neurônios inibitórios. A técnica permite o mapeamento extensivo e a análise quantitativa de circuitos sinápticos locais de neurônios corticais inibitórios específicos.

Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação

Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.

Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.

Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

Aqui, apresentamos um procedimento para a realização de imagens de Ca 2 + em larga escala com resolução celular em múltiplas camadas corticais em camundongos que se movem livremente. Centenas de células ativas podem ser observadas simultaneamente usando um microscópio em miniatura montado na cabeça acoplado com uma sonda de prisma implantada.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

As áreas sensoriais primárias no neocórtex exibem atividades espontâneas únicas durante o desenvolvimento. Este artigo descreve como visualizar atividades de neurônios individuais e áreas sensoriais primárias para analisar atividades síncronas específicas de área em camundongos neonatais in vivo.

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Aqui, empregamos HD-MEA para nos aprofundarmos na dinâmica computacional de conjuntos neuronais de grande escala, particularmente em hipocampo, circuitos de bulbos olfativos e redes neuronais humanas. A captura da atividade espaço-temporal, combinada com ferramentas computacionais, fornece insights sobre a complexidade do conjunto neuronal. O método melhora a compreensão das funções cerebrais, potencialmente identificando biomarcadores e tratamentos para distúrbios neurológicos.

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Aqui, apresentamos dois protocolos para registro de microeletrocorticografia de alta densidade (μEcoG) em ratos e camundongos, incluindo métodos cirúrgicos, de implantação e de registro. As gravações de μECoG são realizadas em combinação com a gravação de politrodo laminar no córtex auditivo de ratos ou com a manipulação optogenética da atividade neural no córtex somatossensorial de camundongos.

Investigações Multiescala de Processamento Cortical Integrando Politrodos Laminares e Optogenética com Microeletrocorticografia em Roedores

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