Name: Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a isolar núcleos intactos do HIV-1 e quantificar o desencapsulamento in vitro usando ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Este método viabiliza estudos sobre fatores celulares e estabilidade viral.

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HIV-1 desencapsulamento estudos em laboratório Aiken foram apoiados pelo NIH concede AI40364, AI50423 e AI076121. Vários materiais-chave, incluindo reagentes utilizados na ELISA p24, foram fornecidos pelo NIH AIDS Programa de Pesquisa e Referência, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH.

1. Produção de partículas de HIV-1 Antes de prosseguir, você deve obter a permissão e siga as orientações do escritório de Biossegurança da sua instituição para trabalhar em uma instalação de biossegurança aprovado para HIV infecciosas. Você deve garantir que a atenção adequada e precauções de segurança são seguidas durante a trabalhar no laboratório de biossegurança. Produção de partículas de HIV-1 é normalmente realizada por transfecção transiente de células 293T com HIV-1 DNA proviral utilizando um método de transfecção de fosfato de cálcio 7, 8. Estoques altos títulos de vírus cresceu em cultura de células T infectadas também são adequados. <ol><li> Cultura 293T células Modified Dulbecco Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e suplementadas com antibióticos [penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 mg / ml)], a 37 ° C CO, 5% 2 . </li><li> Separar células de pratos quase confluentes com 0,25% tripsina-EDTA e sementes de 2x10 6 </li><li> No dia seguinte, a monocamadas de células deve ser de cerca de 25% confluentes e pronto para transfecção. Por seis pratos de células a serem transfectadas, trazer 120 mg de DNA proviral até um volume de 2,7 ml com água estéril. Para esta mistura adicione 0,3 ml de 2,5 M CaCl 2 e 3 ml de 2XBBS, e misture bem por pipetagem cima e para baixo várias vezes. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 10-20 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml da mistura resultante gotas para o centro de cada prato enquanto agita suavemente para misturar. Coloque os pratos durante a noite (~ 16 horas) em um conjunto de incubadora a 35 ° C e 3% CO 2. </li><li> Aspirar o meio de cultura e gentilmente adicionar 5 ml de PBS. </li><li> Aspirar PBS e adicionar 5 ml de meio fresco. Cultura das células na incubadora a 37 edeg; C e 5% de CO 2 para adicional de 24-48 horas. </li><li> Recolher o sobrenadante de cultura contendo partículas virais, transferi-lo para um tubo de centrífuga 50 ml. Combine os sobrenadantes de todos os pratos e centrifugar a 1.500 xg por 5 min para as células pellet e detritos. Filtrar o sobrenadante usando 0,45 mM filtros de poros de tamanho da seringa. Devem ser tomadas precauções para minimizar a formação de aerossóis durante o trabalho com o vírus vivo. Isso inclui o uso de tubos cônicos com O-rings ou tampas balde rotor durante a etapa de centrifugação. Se isso não for possível, as tampas dos tubos deve ser envolvido com parafilme. </li></ol> 2. Concentração de HIV-1 virions por ultracentrifugação <ol><li> Coloque o sobrenadante da cultura (30 ml) em um tubo de centrífuga 38,5 ml polyallomer (para rotor Beckman SW32Ti ou equivalente). Suavemente underlay o sobrenadante contendo vírus com 5 ml de solução de sacarose 20% em PBS usando uma pipeta de 5 ml. </li><li> Centrifugar por 3 horas a32.000 rpm a 4 ° C (175.000 xg em r max) de partículas do vírus da pelota. </li><li> Retire o sobrenadante por aspiração, tomando cuidado para não perturbar o pellet no fundo do tubo. Adicionar 0,5 ml de tampão 1XSTE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) para o tubo e colocar a 4 ° C por 1 hora para soltar o pellet. Usando um wide-bore uma ponta da pipeta pipeta suavemente ml cima e para baixo algumas vezes para retirar o sedimento do fundo do tubo. Em seguida, transferir o pellet afrouxou a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, tendo o cuidado de evitar a formação de espuma. Incubar a 4 ° C por mais de 1-3 horas para permitir que os pequenos aglomerados de vírus para dispersar. Durante esse período, prepare o gradiente de sacarose como descrito no passo 3.1. </li><li> Pipeta suavemente a suspensão de vírus para cima e para baixo várias vezes e centrifugar a 8.000 rpm (6.000 xg) a 4 ° C em microcentrífuga refrigerada por 1 min para remover aglomerados residual. Manter o frio da amostra durante este processo. </li></ol> 3. Gradiente de sacarosecentrifugação para isolar núcleos HIV-1 núcleos estão isolados utilizando um "spin-thru" método 9, que é uma modificação do método descrito anteriormente para a purificação de HIV-2 núcleos 10. <ol><li> Prepare um gradiente de sacarose 12 ml linear de 30% a 70% em tampão 1XSTE em um tubo de centrífuga 14,5 ml polyallomer para SW32.1Ti rotor. Para preparar gradiente, use um gradiente de 20 ml anterior; lugar 6 ml da solução de sacarose 70% no lado mais próximo (perto da porta de saída) e 6 ml da solução de sacarose 30% do outro lado. Certifique-se que as bolhas de ar não são presos no canal que liga as duas câmaras. Use o Auto gradiente DENSI Flow-ex para bombear o gradiente de baixo para cima do tubo contendo 1 ml da solução de sacarose 85% na parte inferior. Delicadamente, coloque o gradiente de temperatura de 4 ° C até refrigerado (2-4 horas). </li><li> Usando um wide-bore uma ponta da pipeta ml suavemente o gradiente overlay com 0,25 ml da solução de sacarose 15% em STE contendo 1% Triton X-100. </li> Suavemente sobreposição com 0,25 ml da solução de sacarose 7,5% em STE usando um wide-bore uma ponta da pipeta ml. Tenha cuidado para não misturar as camadas. <li> Suavemente sobreposição com 0,5 ml de suspensão de vírus a partir do passo 2.4. Esta etapa deve ser realizada com cuidado para evitar qualquer perturbação no gradiente e mistura das camadas de sacarose underlaid. </li><li> Coloque os tubos no balde SW32.1Ti pré-resfriado e centrifugar a 32.000 rpm (187.000 xg em r max) durante a noite (16-20 horas) a 4 ° C. Para evitar a pausa da centrífuga, não comece a centrifugação até o vácuo na centrífuga chega a 250 mM </li><li> Colete 1 ml frações de cima para baixo do gradiente usando o gradiente de fraccionamento da Auto-DENSI-Flow. Coloque os tubos em gelo imediatamente após a coleta. Misturar o conteúdo dos tubos por inversão várias vezes, e retirar 50 ul de cada fração para a quantificação por ELISA ou ensaio de atividade da transcriptase reversa. </li></ol> 4. Localização de núcleos de HIV-1e armazenamento de núcleos <ol><li> Antes de realizar ensaios desencapsulamento, é importante para determinar quais frações contêm intacta HIV-1 núcleos. Isto pode ser determinado por ELISA p24 ou ensaio de atividade da transcriptase reversa usando os 50 mL alíquotas a partir do passo 3.6. </li><li> A recuperação da CA associado com os núcleos é muitas vezes relacionada com a estabilidade dos núcleos. Medir o núcleo associado CA por ELISA p24 9, utilizando uma amostra de cada fração. Alternativamente, medir a atividade da transcriptase reversa de cada fração. Usando ambos os métodos o pico deve ser em torno fração 10. </li><li> Piscina as frações contendo núcleos. Se os núcleos não devem ser usadas para desencapsulamento ensaio imediatamente, alíquota dos núcleos reunidos em 0,2-0,3 ml alíquotas, flash freeze-em N2 líquido e armazenar a -80 ° C. Núcleos congelados desta forma são adequados para o ensaio desencapsulamento. O rendimento do CA-core é tipicamente associada 1-2 mcg por mililitro de p24 ou cerca de 15% do total virion-associadop24. </li></ol> 5. Ensaio de cinética de HIV-1 desencapsulamento <ol><li> A quantidade de HIV-1 núcleos necessária por reação desencapsulamento é de aproximadamente 50 ng. Para executar o ensaio in vitro desencapsulamento, Pré-diluir a alíquota de núcleos com um volume igual de tampão 1XSTE frio para reduzir a viscosidade da suspensão e para minimizar os erros de pipetagem. </li><li> Diluir ainda mais 100 ul dos núcleos em 0,15 ml de tampão 1XSTE frio contendo 10 mg / ml de BSA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Nós complementar o tampão STE com BSA (10 mg / ml) para minimizar a adsorção do CA para as paredes do tubo. Misture por vezes invertendo o tubo várias. Não vortex as amostras. Incubar os tubos em banho-maria a 37 ° C por intervalos de tempo (15, 30, 60 e 120 min). Os tubos devem ser imersas em banho de água pelo menos até o nível da amostra interna a fim de garantir até mesmo o aquecimento. </li><li> Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo do tubo periodicamente (normalmente 5 -10 min) por um movimento súbito do tubo. Para um controle minuto zero, diluir 100 ml de núcleos em 0,15 ml de tampão 1XSTE frio e incubar no gelo por todo o comprimento do experimento (120 min). O controle minuto zero dá o valor desencapsulamento basal e é usado para determinar aumento de desencapsulamento de núcleos incubados a 37 ° C por diferentes intervalos de tempo. </li><li> No final do período de incubação, parar o processo de desencapsulamento colocando os tubos em gelo durante 10 minutos. </li><li> Centrifugar os tubos a 45.000 rpm (TLA-55 rotor; 125.000 xg em r max) por 20 minutos a 4 ° C. Isto pellet núcleos intactos e os CA livre liberado como resultado de desencapsulamento de núcleos permanecerão no sobrenadante. O rotor deve ser pré-resfriada a 4 ° C antes de carregar as amostras. </li><li> Transfira o sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga pré-resfriada de preferência usando gel-carregamento dicas armazenados em temperatura ambiente. Por favor, note que o pellet não será visível a olho nu, por isso tome cuidado extremo wnquanto pipetagem fora o sobrenadante. Volte a suspender as pellets em 250 mL de ELISA diluente de amostra (0,5% Triton X-100 e 5% dos doadores soro bovino em PBS). Para garantir a dissolução eficiente do pellet, vortex após adicionar o diluente de amostra ELISA. Quantificar o conteúdo de CA do pellet e sobrenadante usando ELISA p24 como descrito na seção seguinte. </li><li> A extensão da desencapsulamento é obtido através do cálculo da fração de CA presentes no sobrenadante. </li></ol> 6. Ensaio para a CA por ELISA p24 <ol><li> Muitos kits comerciais ELISA estão disponíveis e podem ser usados ​​para quantificar CA. Usar qualquer comercial ou "in-house" ELISA e incluem padrões p24 para determinar a linearidade do ensaio. Diluições das amostras devem ser testados para garantir a precisão. </li><li> Temos desenvolvido um ELISA caseiros que usam rotineiramente para ensaio para CA. O procedimento é adaptado de um relatório anterior 11 e é realizada utilizando detector de captura e anticorpos disponível a partir de AID NIHS Programa de Pesquisa e de reagente de referência. </li></ol> 7. Resultados representativos: Um exemplo de um resultado de ELISA para determinar frações contendo núcleo é mostrado na Figura 1. Após a coleta de frações (1 ml cada), 50 mL de amostra de cada fração foi usada para fazer diluições seriadas e analisados ​​por ELISA. O p24 total obtido somando os valores de doze frações foi de 14,5 mg. Como mostrado nas frações figura 8 a 10 núcleos contidos. O valor para as frações p24-core contendo 2,17 mg foi. A porcentagem de núcleos associados p24 (14,97%) foi determinado tendo a relação de valor para as frações p24 core (2,17 mg) para o valor total p24 (14,5 mg). Fração 1 ou 2 conterá sempre maior quantidade de p24, o que representa CA livre que não está associado com os núcleos. Isto é seguido por uma redução gradual nos valores de p24 com cada fração subseqüente, em seguida, um aumento acentuado e, finalmente, uma gota afiada no p24valores. Se é bom tomar cuidado ao carregar o gradiente, em seguida, o pico de core-associados da CA é encontrado em torno fração 10. Um resultado típico obtido através do ensaio de cinética de desencapsulamento de HIV-1 núcleos é mostrado na Figura 2. O gráfico mostra um aumento tempo-dependente em desencapsulamento de tipo selvagem HIV-1 núcleos. O percentual desencapsulamento valor foi obtido através do cálculo da fração de CA presentes no sobrenadante. Com a prática, o ensaio é altamente reprodutível e é útil para determinar a estabilidade dos núcleos viral in vitro. Por favor, note que a reprodutibilidade do ensaio é altamente dependente do tratamento adequado das amostras durante o procedimento. Uma vez que os núcleos são instáveis ​​o calor, as amostras devem ser mantidas a 4 ° C durante todo o ensaio, exceto durante o período de incubação. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Equilibrium centrifugação em gradiente de densidade deHIV-1 núcleos. A suspensão de vírus concentrado foi aplicado para o topo de um gradiente de sacarose 30 a 70% linear coberta com 1% Triton-X-100. Após centrifugação durante a noite a 187.000 xg e 4 ° C, 1 ml foram coletadas frações de cima (Fração 1) para baixo (Fração 12) e p24 foi quantificada por ELISA. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 curso Hora do HIV-1 desencapsulamento in vitro. Purificada HIV-1 núcleos foram diluídos e incubados a 37 ° C para os intervalos de tempo indicado. A amostra min zero foi incubado em gelo por todo o comprimento do experimento. Após a incubação, as amostras foram ultracentrifugadas em 125.000 xg por 20 minutos a 4 ° C. Sobrenadante e pelotas foram separados e analisados ​​por ELISA p24. A extensão da desencapsulamento foi determinada conforme descrito no texto do protocolo. Cada reação desencapsulamento foi realizada em duplicata; barras de erro abrange a gama dos dois valores.

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<li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li>
<li>Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores%3A+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6%28gag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito aqui para purificar HIV-1 núcleos para estudar desencapsulamento in vitro é útil para estudar esta fase do ciclo de vida do HIV-1, especialmente devido à indisponibilidade de um método validado para analisar HIV-1 desencapsulamento em células-alvo. Embora este método usa ultracentrifugação equilíbrio para purificar núcleos, outros autores utilizaram a peletização direta após lise breve com 1% Triton X-100-12, 13 ou peletização através de uma almofada de sacarose sobrepostas com 0,1% Triton <...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Nome do reagente </td><td width="197"> Companhia </td><td width="114"> Número de catálogo </td><td width="161"> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% tripsina-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Composição: 50mm BES [p H 6,95], 280 mM NaCl e 1,5 mM Na 2 HPO 4. Ajustar o pH a 6,95em temperatura ambiente. Filtro de esterilizar e armazenar em alíquotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpo de revestimento: anticorpo monoclonal para p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS Research and Reference Programa Reagente </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo primário: HIV-Ig (soro hiperimune paciente humano) </td><td> NIH AIDS Research e Programa de reagente de referência </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo secundário: Cabra anti-IgG humana, conjugado com peroxidase </td><td> Perfurar </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> Substrato HRP </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96 placas bem </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti e rotores SW32.1 Ti e ultracentrífuga compatível </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 rotor e ultracentrífuga tabletop </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga de alta velocidade </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto DENSI-Flow de fraccionamento da gradiente de densidade </td><td> Labconco Corp </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> O ex-gradiente </td><td> CBS Scientific Co. Inc. </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

em desencapsulamento vitro do hiv-1 cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

O genoma do retrovírus é envolto em um capsídeo cercada por um envelope lipídico. Para lentivírus, como o HIV-1, o shell do capsídeo cônica é composto de proteína CA organizados como uma rede de hexágono. O capsídeo é fechada por sete pentamers no final largo e 5 na parte mais estreita do cone 1, 2. Encerradas nesta shell capsídeo é o complexo ribonucleoproteína viral, e juntos eles compõem o núcleo. Após a fusão da membrana viral com a membrana da célula-alvo, o HIV-1 é liberada no citoplasma. O capsídeo, em seguida, liberando desmonta CA livre na forma solúvel 3 em um processo conhecido como desencapsulamento. A localização intracelular eo calendário de HIV-1 desencapsulamento são mal compreendidos. Único amino-ácido substituições em CA que alteram a estabilidade do capsídeo também prejudicar a capacidade do HIV-1 para infectar as células 4. Isso indica que a estabilidade do capsídeo é crítico para infecção VIH-1. </p&gt; HIV-1 desencapsulamento tem sido difícil de estudar por falta de disponibilidade de ensaios sensíveis e confiáveis ​​para este processo. Aqui nós descrevemos um método quantitativo para o estudo in vitro utilizando desencapsulamento núcleos isolados de HIV-1 infecciosas partículas. A abordagem envolve o isolamento de núcleos por sedimentação de partículas virais concentradas através de uma camada de detergente e em um gradiente de sacarose linear, no frio. Para quantificar desencapsulamento, os núcleos isolados são incubados a 37 ° C para vários intervalos de tempo e posteriormente peletizadas por ultracentrifugação. A extensão da desencapsulamento é analisada pela quantificação da fração do CA no sobrenadante. Esta abordagem tem sido empregada para analisar os efeitos das mutações virais do HIV-1 estabilidade capsídeo 4, 5, 6. Deve também ser útil para estudar o papel dos fatores celulares em HIV-1 desencapsulamento.

Desencapsulamento é um passo essencial na fase inicial do ciclo de vida do HIV-1 e é definido como a desmontagem do shell capsídeo ea liberação do complexo de ribonucleoproteína viral (vRNP). Aqui, nós demonstrar técnicas para isolar núcleos intactos de HIV-1 virions e para quantificar a sua desencapsulamento<em&gt; In vitro</em&gt;.

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

O genoma dos retrovírus está envolto em um capsídeo cercado por um envelope lipídico. Para lentivírus, como o HIV-1, a casca do capsídeo cônico é...

O objetivo geral deste procedimento é realizar o revestimento in vitro de ENC com HIV tipo um. Isso é realizado primeiramente produzindo partículas de HIV tipo um. Em seguida, as variantes são concentradas por ultracentrifugação. O próximo passo é isolar o ENC por meio de ultracentrifugação em gradiente de sacarose.Por fim, é realizado um ensaio cinético do desencapsidamento do HIV-1. Os resultados finais mostram o desencapsidamento dependente do tempo do HIV-1 causado pela quantificação do conteúdo de cálcio no pellet e no sobrenadante por ELISA. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do HIV-1, como o papel de fatores celulares no desencapsidamento e o efeito de mutações na estabilidade do capsídeo viral antes da integração.Você deve obter permissão e seguir as orientações do escritório de biossegurança da sua instituição para trabalhar em uma instalação de biossegurança com HIV-1 infeccioso. Deve-se ter cuidado e manipular adequadamente ao trabalhar em um laboratório de biossegurança. Nesta demonstração, partículas de HIV-1 são produzidas por transfeção transitória de células 293T com DNA proviral de HIV-1.Utilizando um método de transfeção por fosfat

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Compreender as conformações dos antígenos de superfície viral é necessário para avaliar a neutralização de anticorpos e orientar o projeto de imunógenos vacinais eficazes. Aqui descrevemos um ensaio ELISA baseado em células que permite o estudo do reconhecimento do Env trimérico do HIV-1 expresso na superfície das células transfectadas por anticorpos anti-Env específicos.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

Este protocolo descreve o NAME, um ensaio que permite a rápida identificação de moléculas capazes de inibir in vitro as atividades chaperonas da proteína do nucleocapsídeo do HIV-1.

Nucleocápside Annealing-Mediated Eletroforese (NAME) ensaio permite a identificação rápida de HIV-1 Nucleocápside Inibidores

Ilustramos aqui um ensaio de ligação à membrana in vitro no qual as interações entre HIV-1 Gag e membranas lipídicas são analisadas visualmente usando Gag marcado com YFP sintetizado em um sistema de tradução in vitro baseado em gérmen de trigo e GUVs preparados por uma técnica de eletroformação.

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

Este relatório descreve um ensaio in vitro para medir a atividade de integração associada ao complexo de pré-integração (PIC) do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) nos extratos citoplasmáticos de células agudamente infectadas. A integração do DNA do HIV-1 associado a PIC no DNA alvo heterólogo é quantificada usando uma estratégia de reação em cadeia da polimerase em tempo real aninhada.

Medição de In Vitro Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.

Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Este método fornece um protocolo acessível e flexível para a preparação de grades de microscopia eletrônica (ME) para criotomografia celular in situ e microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM).

Preparo de Amostras para Criotomografia In Situ de Células de Mamíferos

Aqui, descrevemos alguns métodos estabelecidos para determinar o estresse do retículo endoplasmático (ER) e a ativação da resposta proteica desdobrada (UPR), com ênfase particular na infecção pelo HIV-1. Este artigo também descreve um conjunto de protocolos para investigar o efeito do estresse do RE/UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion.

Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

Aprenda a isolar núcleos intactos do HIV-1 e quantificar o desencapsulamento in vitro usando ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Este método viabiliza estudos sobre fatores celulares e estabilidade viral.

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

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