Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

O objetivo geral deste procedimento é realizar o revestimento ENC in vitro do HIV uma causa Isso é realizado primeiro produzindo partículas de HIV uma. As variantes são então concentradas por ultracentrifugação. O próximo passo é isolar a causa por ultracentrifugação com gradiente de sacarose.

Finalmente, é realizado um ensaio cinético de HIV V um descobrimento. Em última análise, os resultados mostram que o revestimento dependente do tempo do HIV é uma causa por meio da quantificação do conteúdo de ca no palato e sobrenadante por Eliza. Este assunto pode ajudar a responder a questões-chave no preenchimento do HIV one, como o papel dos fatores celulares na codificação e o efeito das mutações na estabilidade da captura do vírus antes da prolina.

Você deve obter permissão e seguir as diretrizes do escritório de biossegurança de sua instituição para trabalhar em uma instalação de biossegurança para o HIV V infeccioso. O manuseio e os cuidados adequados devem ser tomados ao trabalhar em um laboratório de biossegurança. Nesta demonstração, as partículas do HIV são produzidas pela transfecção transitória de 2 9 3 células T com DNA proviral do HIV.

Usando um método de transfecção de fosfato de cálcio no dia anterior à transfecção obtido previamente cultivado 2 9 3 células T e destacando-os das placas usando 0,5% viagens em sementes de EDTA seis placas de cultura de 100 milímetros para a produção de variantes No dia seguinte, a monocamada de células deve ser cerca de 25% cofluente e pronto para a transfecção para seis placas de células. Para ser transfectado, use 120 microgramas de DNA proviral para preparar uma mistura contendo cloreto de cálcio e melhor solução salina tamponada conforme descrito no protocolo escrito, adicione um mililitro da mistura resultante, gota a gota no centro de cada prato enquanto gira suavemente para misturar. Coloque os pratos durante a noite em uma incubadora ajustada a 35 graus Celsius e 3% de dióxido de carbono.

Após a incubação durante a noite, aspire o meio de cultura e adicione suavemente cinco mililitros de PBS, depois aspire o PBS e substitua por cinco mililitros de meio fresco. Neste ponto, cultive as células em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por mais 24 a 48 horas. Em seguida, colete o supinato de cultura contendo partículas virais e transfira para um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros.

Depois de combinar os sobrenadantes S de todas as placas, centrifugue a amostra em células de pellets e detritos e, em seguida, filtre o SUP Comece a concentração de HIV um furião colocando as culturas sobrenadantes. Em um tubo de centrífuga de poli alam de 38,5 mililitros.

Aplique suavemente o vírus contendo SUP natant com cinco mililitros de sacarose a 20% em PBS usando uma centrífuga de pipeta por três horas a 32.000 RPM e quatro graus Celsius para pellet partículas de vírus. Remova cuidadosamente o SUP Adicione 0,5 mililitros de tampão STE de uma vez ao tubo.

Coloque as amostras a quatro graus Celsius por uma hora para soltar o pellet Depois de uma hora, use uma ponta de pipeta de uma bola larga de um mililitro para separar o pellet do fundo do tubo, pipetando suavemente para cima e para baixo algumas vezes. Em seguida, transfira o pellet solto para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Tomando cuidado para evitar a formação de espuma, incube a quatro graus Celsius por mais uma a três horas para permitir que os pequenos aglomerados de vírus se dispersem após a incubação.

Pipete suavemente a suspensão do vírus para cima e para baixo várias vezes. Finalmente, centrifugue a suspensão a 8.000 RPM em uma micro centrífuga refrigerada por um minuto para remover aglomerados residuais para preparar um gradiente linear de 12 mililitros de 30 a 70% de sacarose. Use um formador de gradiente de 20 mililitros e coloque seis mililitros de solução de sacarose a 70% no lado mais próximo da porta de observação.

Em seguida, coloque seis mililitros de solução de sacarose a 30% no outro lado. Certifique-se de que as bolhas de ar não fiquem presas no canal. Conectando as duas câmaras com um gradiente de fluxo de densidade automática.

O primeiro bombeia o gradiente de baixo para cima de um tubo de centrífuga de poli aamer de 14,5 mililitros contendo um mililitro de solução de sacarose a 85% na parte inferior. Coloque suavemente o gradiente a quatro graus Celsius até esfriar. Uma vez que o gradiente tenha esfriado, use uma ponta de pipeta de um mililitro de diâmetro largo para cobri-la suavemente com 0,25 mililitros de solução de sacarose a 15% em STE contendo 1% de Triton X 100.

Em seguida, cubra suavemente com 0,25 mililitros de solução de sacarose a 7,5% em STE. Tenha cuidado para não misturar as camadas. Agora sobreponha suavemente o gradiente com 0,5 mililitros de suspensão de vírus.

Esta etapa deve ser executada com cuidado para evitar qualquer perturbação no gradiente e mistura das camadas de sacarose subjacentes. Em seguida, coloque os tubos em um balde de centrífuga pré-cifra. Quando o vácuo na centrífuga atingir 250 mícrons, centrifugue as amostras a 32.000 RPM durante a noite a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, colete frações de um mililitro de cima para baixo do gradiente usando o fracionador de gradiente de fluxo de densidade automática. Coloque os tubos no gelo imediatamente após a coleta. Misture o conteúdo dos tubos invertendo várias vezes.

Em seguida, retirar 50 microlitros de cada fração para quantificação por e LSA ou ensaio de atividade da transcriptase reversa. Antes de realizar ensaios de revestimento, determine quais frações contêm HIV V intacto por uma causa e combine as alíquotas conforme descrito no protocolo escrito. Pré-diluir a alíquota de HIV uma causa com um volume igual de frio uma vez tampão STE para reduzir a viscosidade da suspensão e minimizar os erros de pipetagem.

Adicione 0,15 mililitros de tampão frio uma vez STE a tubos de microcentrífuga suficientes para a quantidade desejada de pontos de tempo a serem testados e um controle de zero minuto. O tampão STE pode ser complementado com BSA para evitar a aderência da causa às paredes do tubo. Em seguida, dilua ainda mais 100 microlitros da causa em cada tubo preparado misturado, invertendo o tubo várias vezes.

Coloque um tubo no gelo para o controle de minuto zero, que é usado para determinar o aumento no desrevestimento. Com o tempo nas amostras. Coloque os tubos restantes em banho-maria a 37 graus Celsius.

Certifique-se de que os tubos estejam imersos no banho-maria pelo menos até o nível do líquido interno. Para garantir um aquecimento uniforme, incubar as amostras por intervalos cronometrados. Misture suavemente o conteúdo do tubo periodicamente, sacudindo o tubo no final do período de incubação.

Pare o processo de desrevestimento colocando os tubos no gelo por 10 minutos. Em um rotor de centrífuga pré-centrífuga os tubos de amostra e controle de 45.000 rotações por minuto por 20 minutos de quatro graus Celsius. Isso irá pellet a causa intacta, enquanto o ca livre liberado como resultado do desrevestimento da causa permanecerá no sobrenadante s após a centrifugação.

Transfira o snat para tubos separados e suspenda novamente os pellets. Em 250 microlitros de Eli, um diluente de amostra quantifica o teor de CA no pellet e no sobrenadante usando P 24 Eliza, conforme descrito no protocolo escrito. Finalmente, a extensão do desrevestimento pode ser obtida calculando a fração de ca presente no sobrenadante.

Um exemplo de um resultado do ELIZA para determinar frações contendo causa é mostrado aqui. O ca total também chamado de P 24 obtido pela soma dos valores para 12 frações foi de 14,5 microgramas com frações, oito a 10 contendo a causa. A fração um ou dois sempre conterá a maior quantidade de P 24, que representa o ca livre e não está associado à causa.

Isso é seguido por uma redução gradual nos valores de P 24 com cada fração subsequente, depois um aumento acentuado e, finalmente, uma queda acentuada nos valores de P 24. Se o devido cuidado for tomado ao carregar o gradiente, o pico deve estar sempre próximo à fração 10. Aqui é mostrado um resultado típico obtido pela realização de cinética de desrevestimento do HIV uma causa.

Este gráfico mostra um aumento dependente do tempo no desrevestimento do HIV do tipo selvagem uma causa a porcentagem no valor do revestimento foi obtida calculando a fração de ca presente no supinato, o nível basal de desrevestimento, bem como a taxa de desrevestimento pode variar ligeiramente com os lotes de causa. No entanto, o ensaio é altamente reprodutível e é útil para determinar a estabilidade da causa viral in vitro. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a reprodutibilidade deste ensaio é altamente dependente do manuseio adequado das amostras.

Como o HIV V é um curso, nosso laboratório de calor, é importante manter as amostras a quatro graus durante todo o ensaio, exceto durante o período de incubação.