Name: Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda a preparar fatias de tecido vivo do órgão vomeronasal para imagem de respostas neuronais a feromônios usando camundongos transgênicos expressando G-CaMP2. Este método preserva a morfologia celular intacta.

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Agradecemos a Andrea Moran e aos membros do Serviço de Instalações para Animais de Laboratório (LASF) do Instituto Stowers pelo excelente apoio em manejo animal e serviços técnicos. Este trabalho é financiado por recursos do Instituto Stowers e dos NIH (NIDCD 008003) concedidos a CRY. O conteúdo é de exclusiva responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação ou dos Institutos Nacionais de Saúde. Patente dos EUA em análise para os camundongos tetO-G-CaMP2, pertencente ao Instituto Stowers, CRY e LM.

1. Preparação da solução <ol><li> Prepare 10X R1, R2 10X e 10X soluções R3 acordo com a tabela. R1 <table border="1"><tbody><tr><td> Produtos químicos </td><td> MW (g / mol) </td><td> mM (1X) </td><td> Estoque de 10X (g / L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 125 </td><td> 73,05 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 2,5 </td><td> 1,86 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Um estoque M </td><td> 1 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147,02 </td><td> 2 </td><td> 2,94 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 · H 2 O </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 </td><td> 1,72 </td></tr></tbody></table> R2 <table border="1"><tbody><tr><td> Químico </td><td> MW (g / mol) </td><td> mM (1X) </td><td> Estoque de 10X (g / L) </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,01 </td><td> 25 </td><td> 21 </td></tr></tbody></table> R3 <table border="1"><tbody><tr><td> Produtos químicos </td><td> MW (g / mol) </td><td> mM (1X) </td><td> Estoque de 10X (g / L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 125 </td><td> 73,05 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 2,5 </td><td> 1,86 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Um estoque M </td><td> 2 </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147,02 </td><td> 2 </td><td> 2,94 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Um estoque M </td><td> 5 </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Fazer 1 litro do mouse fluido cérebro-espinhal artificial (mACSF) no dia do experimento, misturando 100 ml de R1 10X e 100 ml de R2 10X em água destilada duas vezes (DDW) e add 1,8 g de dextrose (final 10 mm). Este método de preparação impede a precipitação de carbonato de cálcio em pH elevado. A osmolaridade do mACSF é de cerca de 310-315 mOsm / L. Ajustar a osmolaridade com dextrose ou água se necessário. Aerar a solução com Carboxygen de gás (95% de oxigênio e dióxido de carbono 5%) para pelo menos 30 minutos antes de ajustar o pH da solução para 7,2-7,4. </li><li> Fazer 1 litro de solução de Ringer no dia do experimento, misturando 100 ml de R2 10X e 100 ml de R3 10X no DDW e adicionar 1,8 g de dextrose (10 mM). A osmolaridade e pH da solução de Ringer devem ser semelhantes aos do mACSF. Aerar a solução com gás Carboxygen. </li><li> Prepare 4% baixa temperatura de fusão de agarose (LMA) em qualquer mACSF ou solução de Ringer. Alíquota a agarose derretida em tubos eppendorf e armazenar a 4 ° C até o uso. LMA, que é composto de polissacarídeo purificado, permanece fluido a 37 ° C e solidifica rapidamente em temperatura abaixo de 25 ° C. Estas propriedades o tornam ideal para a incorporação de VNO e fisiologia do tecido vivo. Materiais impuros, tais como agar, não deve ser a escolha para o experimento tecido vivo como componentes descaracterizados pode interferir com a resposta neuronal. </li><li> Prepare estímulos feromônio em solução de Ringer. Para a urina do rato, diluição 1:100 dar origem a respostas robusto. </li></ol> 2. Preparação de fatia VNO <ol><li> Antes de sacrificar o animal, colocar dois tubos de LMA em um bloco de aquecimento e ajuste a temperatura&gt; 60 ° C para derreter a agarose. Uma vez que o gel se liquefaz, os tubos de transferência para um bloco de aquecimento 37 ° C. </li><li> Decapitar um rato G-CaMP2 seguintes CO 2 a eutanásia. Cortar os ossos da mandíbula com uma tesoura para retirar o maxilar inferior. Descolar o tecido palato ridged superior para expor a cavidade nasal (Figura 1A). Separar os maxilares através da inserção de uma lâmina cirúrgica entre os dois incisivos da frente. Remova cuidadosamente os maxilares para expor VNO. Neste ponto, o VNO todo pode ser levantado da ncavidade Asal, segurando no osso da cauda (Figura 1B). Transferir o VNO ao frio solução mACSF oxigenado imediatamente. </li><li> Em âmbito dissecção, separar os dois VNOs usando a ponta do # 5 fórceps deslize suavemente ao longo da parede septal do osso (Figura 1C). Descascar o osso vômer que envolve o tecido VNO. Levantar delicadamente o tecido VNO inteiro a partir da cavidade óssea. Extremo cuidado deve ser tomado nesta etapa para não danificar o neuroepitélio. Pequenos fragmentos ósseos deixados na superfície do tecido deve ser removido completamente antes de incorporação. Fragmentos deixados no tecido pode ser capturado pela lâmina de corte para puxar o tecido fora do bloco de agarose. </li><li> Use a pinça para segurar a extremidade posterior do tecido VNO e delicadamente mergulhe-a na agarose derretida (Figura 1D). Rapidamente esfriar o tubo em gelo para solidificar a agarose. O processo de incorporação e de refrigeração deve demorar menos de 2 minutos. </li><li> VF300 slicer tecido (Instr Precisionarytos, Greenville, NC) é usado para fazer seções. Cortar o bloco de agarose contendo o VNO em forma e cola-lo ao titular do tecido (Figura 1E e F). Insira o suporte de tecido para dentro do cilindro de metal e encha a câmara restante com LMA adicionais. Uma vez que a LMA solidifica em gelo, vá para a secção imediatamente. Fornecimento mACSF oxigenado frio na câmara de corte e começar a cortar na espessura de 180-200 mM por fatia. Ajustar a velocidade de avanço e freqüência de vibração, para que o tecido não é comprimida durante o corte e VNO não cair da agarose. Coletar e transferir as fatias seccionadas para mACSF câmara de incubação (Figura 2A). As fatias são viáveis ​​por 6-8 horas em mACSF oxigenada em temperatura ambiente. Figura 2B e C mostram imagens DIC e 2-fótons de uma fatia VNO G-CaMP2, respectivamente. </li></ol> 3. Imagens da câmara configurado <ol><li> Coloque a fatia VNO no meio da perfusãocâmara (Siskiyou, Grants Pass, OR) e segure a fatia para baixo com uma âncora fatia (Warner Instruments, Hamden, CT) (Figura 3A). Os fios da âncora só deve pressionar contra a parte da fatia de LMA, mas não o tecido VNO. Oxigenado mACSF é entregue à câmara de perfusão através da porta de entrada em ~ 100 l / seg eo líquido é drenado através de uma agulha de sucção através da porta de saída para fornecer um fluxo contínuo de mACSF fresco (Figura 3A e B). </li><li> Encher uma seringa de 30 ml com solução de Ringer e apertá-lo para a bomba de seringa (Sistemas Bomba New Era, Farmingdale, NY). Definir a velocidade da bomba de 300-600 mL / min para fornecer um fluxo contínuo de solução de Ringer sobre a fatia (Figura 3C). </li><li> Conecte a saída do da campainha para uma injeção HPLC loop (Chromtech, Apple Valley, MN) (Figura 3D). Tamanho do loop diferentes podem ser selecionados para controle preciso do volume a ser entregue. Usamos um loop 20 l em oexperimentos ur. O controle de loop de injeção possui duas rotas de fluxo (Figura 3E). No "load" de posição, as amostras podem ser carregados para o loop de amostra com uma seringa de precisão Hamilton. Excesso de saídas de amostra do loop de amostra através da saída de resíduos. Solução de Ringer injetada pela bomba de seringa ignora o circuito de amostra e vai diretamente à tomada, que é conectado à ponta de perfusão (Figura 3A e E). Em "injeção" de posição, a solução da bomba flui através do circuito de amostra e empurre os estímulos à tomada (Figura 3E). Antes do experimento de imagem, bolhas de ar devem ser expulsos para garantir fluidez do líquido de perfusão. Outros comerciais ou de sistemas de injeção personalizado feito também pode ser implementado para entrega de estímulo. </li><li> Ajuste a ponta de perfusão sob uma lente de 5x ou 10x de modo que a ponta é cerca de 1 mm de distância da fatia VNO. </li><li> Quando um sistema de perfusão nova configuração, é aconselhável para medir o tempo de atraso de amostra e durração com corante fluorescente. Carga corante rodamina 6G 0,1% para o loop de amostra e mudar a válvula para injetar posição menos 5 segundos após o início da aquisição da imagem (Figura 3F). O sinal fluorescente é detectado entre 10-30 segundos. A curva de sinal fluorescente também indica que há pouca turbulência gerada sob a lente de imersão e que a perfusão adequada dos mACSF oxigenado atinge a fatia. </li></ol> 4. Lapso de tempo de imagem <ol><li> Nós usamos o microscópio Zeiss AxioSkope FS2 com uma lente de 10X ou 20X de água-dipping para imagens lapso de tempo. Padrão bandpass GFP filtro (450-490nm) é usado para G-CaMP2 sinais. As imagens de epifluorescência são adquiridas por uma câmera CCD (Zeiss HRM) com 1X1 ou 2x2 binning dependendo do nível de expressão de G-CaMP2. </li><li> Definir a velocidade de aquisição de 1 frame por segundo. Ajustar a intensidade da luz para minimizar os sinais de branqueamento de G-CaMP2 foto e danos às células. Para cada exmentam, que normalmente adquirem uma pilha de imagens de 60 quadros (~ 60-70 segundos). Interruptor da válvula para a posição de injeção em um ponto de tempo específico (por exemplo, 5 segundo na Figura 3F) para um conjunto de experiência para obter tempo de atraso consistente em todos os ensaios. </li><li> Realizar um ensaio utilizando solução de Ringer como o estímulo. Re-ajustar a configuração de perfusão se artefato movimento é introduzido durante a injeção da amostra. </li><li> Realizar um controlo positivo correr com urina do rato diluído a 1:100 em solução de Ringer. O típico valor de ΔF / F máximo de G-CaMP2 resposta a urina do rato é de cerca de 20-40%. Se necessário, pode-se confirmar a viabilidade da fatia, oferecendo 10 mM KCl em solução de Ringer para estimular as fatias no final dos experimentos. </li><li> Lavar a seringa Hamilton em solução de Ringer com pelo menos três vezes depois de carregar um estímulo. Lavar o circuito da amostra com solução de Ringer, pelo menos, três vezes entre diferentes estímulos. Estes passos evitar a contaminação cruzada entre os difereamostras nt. </li><li> Espere por 40-10 min para o VSNs para recuperar antes de aplicar o estímulo seguinte. </li></ol> 5. A análise dos dados <ol><li> Realizar o registro de imagem de todas as imagens adquiridas a partir de uma fatia. Nós usamos uma custom-script VBA escrito em AxioVision (Carl Zeiss, América do Norte) para automatizar esse processo. Todos os quadros de imagem dentro do mesmo experimento são registradas contra um quadro de referência comum escolhido com elástico registo (Figura 4A). Elástica de registro, também conhecido como registro não-linear, é uma categoria de técnica de registro de imagem com ênfase na transformação de uma imagem-alvo não rigidamente a uma imagem de referência. Aqui usamos a implementação de AxioVision. Este quadro de referência é escolhido arbitrariamente das pilhas de imagem. </li><li> Executar a subtração de imagem para identificar as células responder. Nós usamos macros personalizadas escrito em ImageJ v1.42 ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> , NIH, Bethesda, MD) para automatizar esse processo. A imagem de projeção mínima é gerado para cada pilha. Células que respondem surgir após a projeção mínima é subtraído do stacks-primas (Figura 4B). </li><li> Identificar regiões de interesse (ROI) das pilhas subtraído e obter o ROI utilizando coordenadas Multi-Measure plugin de ImageJ. Processo de todas as pilhas de um experimento e salvar todos os ROI coordenadas em uma lista mestra ROI (Figura 4C). </li><li> Use a lista principal ROI para medir as respostas de células a partir de pilhas de imagens brutas com custom-written macro e Multi-Measure plugin do ImageJ (Figura 4D). Plot curvas de resposta e heatmap em Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA). </li></ol> 6. Resultados representante Um exemplo da experiência de imagem VNO utilizando amostras de urina coletadas de quatro camundongos indivíduo é mostrado na Figura 5. A fatia responde à estimulação de urina com diversas patterns de ativação. Cerca de 80 células são identificadas mostrando resposta a pelo menos um dos estímulos de urina e sua resposta ΔF / F valores são plotados no mapa de calor (Figura 5A). Os traços resposta das células 1, 2 e 3 são plotados em Figura 5B mostra a ativação curso de tempo por estímulos urina. Célula 1 exibe resposta a ambas as amostras de urina feminina, mas não as amostras do sexo masculino, enquanto célula 2 mostra os padrões de ativação oposto e responde a ambas as amostras do sexo masculino. Célula 3 é ativado por ambas as amostras individuais masculino e feminino. Células 1 e 2 mostram resposta característica ao sexo sugestões específicas na urina 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Ilustração esquemática da VNO processo de dissecação. A. A localização anatômica do VNO na cabeça de rato. A cabeça de um rato G-CaMP2 foi dissecado e é colocada de cabeça para baixo com o t molesquestão removido do palato para expor o VNO. De entrada mostra uma imagem fluorescente do mesmo quadro. O neuroepithelia do VNO são verdes brilhantes. B. A vista lateral do VNO isolado que é fechado no osso vômer (em cima) ea imagem fluorescente do VNO mesmo (baixo). C. Uma visão coronal do VNO e dissecção processo. Um VNO é separada do septo eo osso vômer pode então ser removido para livrar o neuroepitélio. D. VNO é incorporado LMA. E. O bloco embutido é colado ao titular de tecido para corte. O titular tecido é avançada no 180-200 mM por fatia empurrando o bloco de agarose para fora do cano de metal para corte. A lâmina de corte é posicionada perto do barril de metal. F. Vista lateral do sistema slicer VF300 tecido. BV, dos vasos sanguíneos. NE, neuroepitélio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> A. VNO são mantidos em mACSF oxigenada em temperatura ambiente. B. Uma imagem DIC da fatia VNO. C. A imagem 2-fótons do VNO de G-CaMP2 mouse. Barra de escala, 50 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Ilustração da configuração do sistema de perfusão. A. A câmara de perfusão típico, com entrada e saída. Fatia VNO é posicionado no centro da câmara e pressionou para baixo com uma âncora de tecido. Os fios são removidos do meio da âncora do tecido de modo que o tecido VNO não está pressionado. B. A câmara de perfusão é colocado no palco microscópio no âmbito do objectivo de imersão. A entrada mACSF tomada de aspiração, e ponta de perfusão são indicados. C. A bomba de seringa barril proporciona um fluxo contínuo de Ringer com a ponta de perfusão. D. A inje HPLCsistema de circuito ction é adotada para carregamento conveniente estímulo modelo e injeção. E. Ilustração esquemática das direções de fluxo em carga e posições de injeção. Ringer, verde. Amostra de estímulo, magenta. Setas indicam o sentido do fluxo. F. Delay e lave medição do tempo do sistema de perfusão. Rodamina 6G corante fluorescente é carregado para o loop de amostra ea válvula é comutada para a posição de injeção na segunda 5, que é indicado com uma seta. A mudança de sinal fluorescente é detectado entre 10-30 segundos e diminui depois. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 pipeline de processamento de imagem. A. Todos os quadros de imagem de uma fatia são registradas contra um quadro de referência. B. A subtração da projeção mínima de uma pilha de seus quadros-primas. Responder células tornam-se proeminentes após a subtração. C. ROIs são selecionados e suas coordenadas são compilados em lista principal. D. Medição de células que respondem usando ROI lista mestra da pilha-primas. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5 Um representante do G-CaMP2 VNO experiência de imagem. A. O heatmap resposta ΔF / F de uma fatia estimulado com urina masculino e feminino individual. Amostras de urina são coletadas de indivíduo camundongos machos e fêmeas. Eixo X, respondendo as células identificadas a partir da fatia. Y-eixo, amostras de urina utilizadas no experimento. Barra de cores indica o valor de ΔF / F. B. claro Tempo de resposta de 3 células representante marcado na Arrows A. indicam o tempo de aplicação do estímulo. F-FVB, fêmea FVB; F-CBA, do sexo feminino CBA; M-FVB, do sexo masculino FVB; M-BL6, do sexo masculino C57BL / 6. Tabela de reagentes e equipamentos específicos: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome doreagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> câmara de perfusão </td><td> Siskiyou </td><td> PC-H </td><td> horizontal </td></tr><tr><td> fatia de fixação </td><td> Warner Instruments </td><td> SHD-22CL </td><td></td></tr><tr><td> titular porta perfusão </td><td> ALA científica, Inc. </td><td> MPIOH-S </td><td></td></tr><tr><td> bomba de seringa </td><td> Sistemas de bomba New Era, Inc. </td><td> NE-300 </td><td></td></tr><tr><td> válvula de injeção de baixa pressão </td><td> Chromtech </td><td> V-451 </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação PEEK </td><td> Chromtech </td><td> 1531 </td><td> 1 / 16 "OD, 0,25 milímetros ID </td></tr><tr><td> PEEK loop de amostra </td><td> Chromtech </td><td> 1803 </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> Hamilton seringa </td><td> Chromtech </td><td> 80630 </td><td> 100 L </td></tr></tbody></table>

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<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li>
<li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Hendel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in.</a> 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+and+%5BCa2%2B%5D+with+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators.</a> J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

A maioria dos receptores vomeronasais (VRs) permanece como receptores órfãos desde sua descoberta por Dulac e Axel 5. Os ligantes feromônicos desses receptores quimiossensoriais e seus papéis na mediação de comportamentos animais ainda não são bem compreendidos. Até o momento, apenas um par ligante/receptor, o peptídeo ESP1 e seu receptor cognato, Vmn2r116 (V2Rp5), foi identificado e demonstrado transmitir informações sociais específicas 19,23. Outro receptor, V1rb2, demonstrou responder à 2-heptano...

responses imagem neuronal em preparações slice of organ vomeronasal expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

O órgão vomeronasal (OVN) detecta sinais quimiossensoriais que carregam informações sobre o status social, sexual e reprodutivo de indivíduos da mesma espécie 1,2. Esses sinais intraespécie, as feromônas, bem como sinais de alguns predadores 3, ativam os neurônios sensoriais vomeronasais (NSVs) com altos níveis de especificidade e sensibilidade 4. Pelo menos três famílias distintas de receptores acoplados à proteína G, V1R, V2R e FPR 5-14, são expressas nos neurônios do OVN para mediar a detecção dessas pistas quimiossensoriais. Para compreender como a informação feromonal é codificada pelo OVN, é fundamental analisar os perfis de resposta de NSVs individuais a diversos estímulos e identificar os receptores específicos que medeiam essas respostas.
Os neuroepitélios do Órgão Vomeronasal (VNO) estão envoltos por um par de ossos vomerianos. A estrutura tubular semi-cega do VNO possui uma extremidade aberta (o ducto vomeronasal) que se conecta à cavidade nasal. Os neurônios sensoriais vomeronasais (VSNs) estendem seus dendritos até a parte luminal do VNO, onde as pistas feromonais entram em contato com os receptores expressos nas terminações dendríticas. Os corpos celulares dos VSNs formam camadas pseudoestratificadas, com V1R e V2R expressos nas camadas apical e basal, respectivamente 6-8. Várias técnicas têm sido utilizadas para monitorar as respostas dos VSNs a estímulos sensoriais 4,12,15-19. Entre essas técnicas, a preparação de fatias agudas oferece diversas vantagens. Primeiro, em comparação com VSNs dissociados 3,17, as preparações em fatia mantêm os neurônios em sua morfologia nativa e os dendritos das células permanecem relativamente intactos. Segundo, os corpos celulares dos VSNs são facilmente acessíveis em fatias coronais do VNO, permitindo estudos de eletrofisiologia e experimentos de imagem, diferentemente das preparações de epitélio inteiro e em montagem inteira 12,20. Terceiro, este método pode ser combinado com técnicas de clonagem molecular para permitir a identificação de receptores.
A estimulação sensorial provoca uma forte entrada de Ca2+ nas VSNs, o que indica a ativação do receptor 4,21. Assim, desenvolvemos camundongos transgênicos que expressam G-CaMP2 nos neurônios sensoriais olfativos, incluindo as VSNs 15,22. A sensibilidade e a natureza genética da sonda facilitam grandemente os experimentos de imagem de Ca2+. Este método eliminou o processo de carregamento com corante utilizado em estudos anteriores 4,21. Também empregamos um sistema de entrega de ligantes que permite a aplicação de diversos estímulos aos cortes do órgão vomeronasal. A combinação dessas duas técnicas nos permite monitorar simultaneamente múltiplos neurônios em resposta a um grande número de estímulos. Por fim, estabelecemos um fluxo de análise semi-automatizado para auxiliar o processamento de imagens.

O órgão vomeronasal (VNO) detecta sinais químicos intraespecíficos que transmitem informações sociais e reprodutivas. Realizamos experimentos de imagem de Ca2+ utilizando camundongos transgênicos que expressam G-CaMP2 no tecido do VNO. Essa abordagem nos permite analisar os padrões complexos de resposta dos neurônios vomeronasais a um grande número de estímulos de feromônios.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

O órgão vomeronasal (OVN) detecta sinais quimiossensoriais que carregam informações sobre o status social, sexual e reprodutivo dos indivíduos dentro de...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como preparar fatias de tecido vivo para a obtenção de imagens das respostas a feromônios em neurônios do órgão nasal MRO. Isso é realizado primeiramente preparando fatias de tecido vivo do órgão nasal MRO ou do órgão vomeronasal (VNO) de camundongos que expressam um indicador genético de cálcio, GCaMP dois. O próximo passo é montar o sistema de perfusão sobre a platina do microscópio para manter a fatia, aplicar o estímulo e realizar a aquisição de imagens.A resposta. Um experimento de imagem com lapso de tempo é então realizado com diversos estímulos de feromônios, seguido pela análise dos dados dos resultados obtidos nas imagens. Por fim, são obtidos os padrões de resposta dos neurônios do órgão vomeronasal a diferentes estímulos de feromônios.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a carga com cálcio D ou a imagem em células dissociadas, é que podemos preservar a morfologia intacta das células, manter melhor a saúde dos cortes e obter um sinal mais forte. Este método pode nos ajudar a responder algumas das questões-chave nos estudos do sistema nasal de vermes, como identificar os ligantes e seus receptores e caracterizar as respostas individuais dos neurônios nasais de vermes. Este método também pode ser aplicado a outros sistemas, como os olfativos, séricos ou cerebrais em casos de psoríase.Em geral, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades devido à complexidade em obter um bom modelo de psoríase e em montar o sistema de perfusão. Antes de iniciar este procedimento, prepare as soluções necessárias, incluindo o ringer de fluido espinhal cerebral artificial para camundongo, solução de agarose de baixo ponto de fusão a 4% e estímulos de feromônios, conforme descrito no manuscrito anexo. Em seguida, coloque dois tubos de agarose de baixo ponto de fusão em um bloco de aquecimento.Defina a temperatura acima de 60 graus Celsius para derreter os aros. Assim que o gel se liquefazer, transfira os tubos para um bloco de aquecimento a 37 graus Celsius. Para preparar as fatias do órgão vomeronasal.Após decapitar um camundongo eutanasiado que expressa GCaMP, corte os ossos da mandíbula com uma tesoura para remover a mandíbula inferior. Em seguida, retire o tecido rugoso do palato superior para expor a cavidade nasal. Depois, separe os ossos da mandíbula inserindo uma lâmina cirúrgica entre os dois incisivos centrais.Remova cuidadosamente o maxilar para expor o órgão vomeronasal. Neste momento, levante todo o órgão vomeronasal da cavidade nasal segurando pelo cóccix. Transfira o órgão vomeronasal para uma solução de LCR de rato oxigenada e fria.Imediatamente sob o microscópio de dissecação, separe os dois VNO deslizando suavemente as pontas da pinça ao longo da parede do osso septal. Remova o osso vulner que envolve o tecido do VNO. Em seguida, levante cuidadosamente todo o tecido do VNO da cavidade óssea.Deve-se ter extrema cautela nesta etapa para evitar danificar o epitélio neural. Em seguida, remova completamente os pequenos fragmentos ósseos deixados sobre a superfície do tecido. Antes de embutir os fragmentos restantes.O tecido pode ser apanhado pela lâmina de corte, o que o puxaria para fora do bloco de aros. Em seguida, use a pinça para segurar a extremidade posterior do tecido do VNO e mergulhe-o suavemente no aros derretido. Resfrie rapidamente o tubo em gelo.Para solidificar o aros, o processo de inclusão e resfriamento deve levar menos de dois minutos. Em seguida, corte o bloco de aros contendo o VNO e cole-o no suporte para tecidos. Posteriormente, insira o suporte para tecidos no cilindro metálico e preencha a câmara restante com mais aros de baixo ponto de fusão.Uma vez que a agarose de baixo ponto de fusão solidifique no gelo, prossiga imediatamente para o fatiamento: forneça artificial cerebrospinal fluid (ACSF) oxigenada e fria para a câmara de corte do fatiador de tecidos e corte as fatias com espessura entre 180 e 200 mícrons cada. Em seguida, colete e transfira as fatias para a câmara de incubação. Os cortes permanecem viáveis por seis a oito horas na ACSF oxigenada de camundongo à temperatura ambiente.Neste procedimento, coloque primeiro uma fatia de VNO no centro da câmara de perfusão e segure a fatia com um suporte para fatias. Os fios do suporte devem pressionar apenas a parte da fatia contendo agarose de baixo ponto de fusão, mas não o tecido do VNO. Em seguida, conduza o LCR A oxigenado de camundongo até a câmara de perfusão através da entrada a cerca de 100 microlitros por segundo.O líquido é drenado por meio de uma agulha de sucção através da porta de saída para fornecer um fluxo contínuo de LCR fresco de camundongo. Em seguida, encha uma seringa de 30 mililitros com solução de Ringer e fixe-a na bomba de seringa. Ajuste a velocidade da bomba para 300 a 600 microlitros por minuto.Para fornecer um fluxo contínuo de solução de Ringer sobre a fatia, conecte a saída do Ringer ao loop de injeção A-H-P-L-C. O controle do loop de injeção possui dois percursos de fluxo. Na posição de carga, carregue a amostra de urina de camundongo no loop de amostra com uma seringa de precisão Hamilton.O excesso de amostra sai do loop de amostragem através da saída de desperdício. A solução de Ringer injetada pela bomba de seringa contorna o loop de amostragem e vai diretamente para a saída, que está conectada à ponta de perfusão na posição de injeção. A solução da bomba flui através do loop de amostragem e empurra os estímulos de feromônio para a saída.Antes do experimento de imagem, remova as bolhas de ar para garantir um fluxo suave do fluido de perfusão. Em seguida, ajuste a ponta de perfusão sob uma lente de cinco x ou 10 x para que a ponta fique a cerca de um milímetro de distância da fatia de vien O.Para medir o tempo de atraso da amostra e a duração, carregue o corante fluorescente 0,1% de rho domine seis G no loop da amostra. Em seguida, mude a válvula para a posição de injeção. Cinco segundos após o início da aquisição de imagens, detecte o sinal fluorescente entre 10 e 30 segundos.A curva suave do sinal fluorescente também indica que há pouca turbulência gerada sob a lente de imersão e que a perfusão adequada de LCR oxigenado de camundongo alcança a fatia em nosso laboratório. O microscópio Zeiss Axio Scope FS2 com uma lente de imersão em água de 10x ou 20x é usado para imagens com lapso de tempo para detecção de sinais GAMP2. Utiliza-se o filtro padrão de passagem de banda GFP de 450 a 490 nanômetros.As imagens epi-fluorescentes são adquiridas por uma câmera CCD com rotação de um por um ou dois por dois, dependendo dos níveis de expressão do GCaMP dois. Primeiro, ajuste a velocidade de aquisição para um quadro por segundo. Ajuste a intensidade da luz para minimizar o desbotamento dos sinais do GCaMP dois e os danos fototóxicos às células.Em seguida, mude a válvula para a posição de injeção em um ponto específico no tempo, de modo que atrasos temporais consistentes sejam obtidos em todos os ensaios dentro de um conjunto de experimentos. Agora, realize uma corrida de teste usando solução de Ringer como estímulo e reajuste a montagem de perfusão caso seja introduzido artefato de movimento durante a injeção da amostra. Depois disso, realize uma corrida de controle positivo com urina de camundongo diluída na proporção de um para 100 na solução, para prevenir contaminação cruzada entre diferentes amostras.Lave a seringa de Hamilton com solução de Ringer pelo menos três vezes após o carregamento de um estímulo. Da mesma forma, lave o loop de amostra com solução de Ringer pelo menos três vezes entre diferentes estímulos antes da aplicação. Aguarde entre quatro e dez minutos antes do próximo estímulo para que os neurônios sensoriais nasais MRO se recuperem, a fim de realizar o registro de imagens de todas as imagens adquiridas de uma fatia.Um script VBA personalizado no Avision é usado para automatizar este processo. Neste caso, todos os quadros de imagem dentro do mesmo experimento são registrados em relação a um quadro de referência comum escolhido com elasticidade para realizar a subtração de imagens e identificar as células responsivas. As macros personalizadas no ImageJ versão 1.42 são utilizadas para automatizar este processo.Uma imagem de projeção mínima é gerada para cada pilha e as células responsivas surgem após a subtração da projeção mínima das pilhas brutas. Em seguida, identifique a região de interesse nas pilhas subtraídas e obtenha as coordenadas da ROI utilizando o plugin multi mesure do ImageJ. Depois, processe todas as pilhas de um experimento e salve todas as coordenadas da ROI em uma lista mestre de ROI. A seguir, utilize a lista mestre de ROI para medir as respostas celulares nas pilhas de imagens brutas com uma macro personalizada e o plugin multi mesure do ImageJ. Em seguida, plote as curvas de resposta e o mapa de calor no Matlab.É apresentado aqui um exemplo do experimento de imagem do OVN utilizando amostras de urina coletadas de quatro camundongos individuais. Cerca de 80 células apresentam resposta a pelo menos um dos estímulos urinários, e seus valores de resposta delta F divididos por F são representados no mapa de calor. Abaixo estão os traços de resposta das células um, dois e três, que mostram a ativação ao longo do tempo pelos estímulos urinários; a célula um exibe resposta a ambas as amostras de urina feminina, mas não às amostras masculinas.Enquanto a célula dois mostra padrões opostos de ativação e responde a ambas as amostras masculinas. Apenas a célula três é ativada por amostras individuais de macho e fêmea. Uma vez realizada, a fatia pode ser preparada em 30 minutos e os neurônios podem ser mantidos vivos por seis a oito horas, se o procedimento for feito corretamente.Ao tentar este método, é importante lembrar de usar reagentes de grau para cultura de tecidos e evitar reagentes de fixação de tecidos em contato com os preparos teciduais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar tecido vivo de psoríase para a obtenção de imagens das respostas térmicas em neurônios de Viena utilizando camundongos que expressam G Camp.

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos uma técnica estabelecida para medir e analisar odor evocadas respostas de cálcio no lobo antenal de...

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (OVN). Aqui, uma preparação fatia aguda do tecido de VNO para a realização de imagens de cálcio é descrito. Esta abordagem permite observações fisiológicos de subpopulações e / ou neurônios individuais em um tecido vivo e é conveniente para receptor-ligante de identificação.

Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

Neste protocolo, atualizar o progresso recente na imagem...

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

O vídeo do protocolo descreve o estabelecimento de um grampo de adesivo de célula inteira para registro eletrofisiológico dos neurônios sensoriais do órgão vomeronasal (VNO) em camundongos. Uma fatia coronal de VNO com neurônios sensoriais marcados com fluorescência é colocada em uma configuração de gravação. Um neurônio marcado é temendado com uma pipeta de registro em uma configuração de célula inteira para registro eletrofisiológico em resposta a estímulos químicos.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais vomeronasalis

Aqui, descrevemos uma abordagem fisiológica que permite a identificação e análise aprofundada de uma população definida de neurônios sensoriais em fatias agudas de tecido coronal do órgão vomeronasal de camundongo usando gravações de patch-clamp de células inteiras.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Aqui apresentamos como expor o gânglio geniculado de um rato de laboratório vivo, anestesiado e como usar imagens de cálcio para medir as respostas desses conjuntos desses neurônios a estímulos de sabor, permitindo múltiplos ensaios com diferentes estimulantes. Isso permite comparações profundas das quais os neurônios respondem a quais tastantes.

In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Apresentamos um protocolo para expor o tronco cerebral do rato adulto do lado ventral. Usando uma lente de índice gradiente-refrativo com um microscópio em miniatura, a imagem de cálcio pode ser usada para examinar a atividade de somata neural inferior de oliva in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Aprenda a preparar fatias de tecido vivo do órgão vomeronasal para imagem de respostas neuronais a feromônios usando camundongos transgênicos expressando G-CaMP2. Este método preserva a morfologia celular intacta.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

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