Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

O objetivo geral deste procedimento é estudar as respostas à luz e a morfologia de neurônios individuais na retina intacta, utilizando uma linhagem de camundongos que expressa um marcador fluorescente exclusivamente em tipos celulares específicos. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do olho para obter uma retina isolada. O segundo passo consiste em posicionar a retina sob um microscópio de varredura a laser e visualizar uma célula por excitação infravermelha de dois fótons.

Uma micropipeta é então utilizada para obter uma configuração de grampo de membrana em todo o célula para registro e preenchimento com corante. Em última análise, este preparo permite o registro de respostas celulares à fotoestimulação e revela a morfologia da célula registrada por microscopia confocal. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o registro por grampo de membrana não guiado na retina, é que o registro pode ser direcionado visualmente a uma célula marcada com fluorescência sem estimular a retina com luz de excitação.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na pesquisa da retina, como qual é a contribuição de uma determinada população celular no processamento da informação visual? Mesmo que a população celular tenha baixa densidade e não apresente características morfológicas distintas que possam facilitar a identificação. Inicie este experimento adaptando o camundongo no escuro por pelo menos três horas antes do experimento.

Enquanto isso, prepare a solução extracelular conforme descrito no manuscrito acompanhante e borbulhe com carbogênio à temperatura ambiente. Em seguida, sacrifique o camundongo e enucleie os olhos com uma tesoura de íris curva. Transfira-os para um recipiente contendo solução extracelular.

Em seguida, coloque-o sob um microscópio estereoscópico com um par de tesouras de mola. Remova a córnea e o corpo ciliar abrindo o bulbo ocular ao longo da ora serrata. Retire a lente e separe cuidadosamente a retina do epitélio pigmentar.

Em seguida, corte o nervo óptico entre a retina e o epitélio pigmentado. Remova a retina da cúpula ocular. Observe que o lado interno da retina enrolada é o lado das células ganglionares.

O lado externo é o lado dos fotorreceptores. Em seguida, remova o vítreo da superfície interna da retina puxando-o suavemente com a ajuda de um palito de dente de madeira. Então, faça pequenas incisões ao longo do perímetro da retina para facilitar o achatamento do tecido.

Em seguida, transfira a retina para a câmara de registro com o lado dos fotorreceptores voltado para baixo. Espalhe-a suavemente no fundo de vidro com um pincel fino e imobilize-a com um quadro de aço inoxidável com fios de náilon. Coloque a câmara de registro no escuro sob um microscópio ereto de varredura a laser.

Superfuse a preparação retiniana continuamente a uma taxa de pelo menos cinco mililitros por minuto. Com solução extracelular oxigenada a base de carboidrato aquecida a 35 graus Celsius, o microscópio está situado sobre uma mesa pneumática amortecedora de choques dentro de uma gaiola de Faraday. Para proteção eletrônica, cubra a gaiola com uma cortina opaca para manter a preparação em escuridão.

Também bloqueamos a luz proveniente de monitores de computador usando filmes transparentes vermelhos. Ajuste o laser de infravermelho para 850 a 870 nanômetros ou comprimentos de onda mais longos. Alterne para o modo travado e utilize excitação por dois fótons para visualizar células que expressam GFP.

Para a gravação em configuração de patch clamp, encha micropipetas de vidro borossilicato com a solução intracelular contendo uma sonda fluorescente conforme descrito no manuscrito acompanhante. Em seguida, insira a micropipeta no suporte. Certifique-se de que o eletrodo de referência esteja em contato com a solução extracelular na câmara de gravação.

Em seguida, aplique pressão na micropipeta sobre uma célula que expressa GFP utilizando uma objetiva de imersão em água de 40 vezes; os corpos celulares ômicos estão localizados na camada de células ganglionares, bem como na parte proximal da camada intercalar, antes de a micropipeta entrar em contato com a célula-alvo e penetrar a membrana limitante interna na superfície retiniana. A penetração bem-sucedida é reconhecida pela solução intracelular que é expelida pela ponta da micropipeta e pelo descolamento da membrana limitante interna do tecido retiniano subjacente. O corante fluorescente na solução intracelular pode revelar a posição da micropipeta na imagem de dois fótons enquanto se aproxima da célula desejada.

Em seguida, libere a pressão do micropipeto e obtenha uma configuração de grampo de membrana em célula inteira. No modo de grampo de corrente, uma gravação utilizável deve apresentar um potencial de membrana de menos 50 a menos 55 milivolts e durar pelo menos 20 minutos. Depois disso, apresente os estímulos visuais criados em um monitor de computador.

Ajuste a intensidade do estímulo inserindo filtros de densidade neutra no trajeto do feixe e regule a posição espacial da estimulação para o centro da célula registrada. Em seguida, inicie o protocolo de estimulação e registre as respostas à luz. Utilize o gerador de estímulos para acionar o software de registro.

Inclua um fotodiodo no trajeto do feixe para registrar a temporização do estímulo. Tenha cuidado para não puxar o corpo celular ao retrair a micropipeta. Quando realizado para preenchimento com corante, deixe o agente fluorescente difundir-se na célula registrada por 30 a 45 minutos.

Aqui é apresentado um exemplo de células que expressam GFP em um preparado plano da retina sob seu promotor para a tirosina hidroxilase, onde duas populações podem ser distinguidas pela intensidade do sinal de GFP. Células dopaminérgicas do tipo um, localizadas na camada interplexiforme, expressam fluorescência fraca, conforme indicado pelas cabeças de seta. Na figura A. Células do tipo dois foram intensamente marcadas e possuem corpos celulares localizados na camada, conforme indicado pelas setas na figura A, ou deslocados na camada de células ganglionares, conforme mostrado na figura B. A figura C mostra a estratificação dendrítica de células do tipo dois no estrato três da camada plexiforme interna; aqui é apresentado um exemplo da morfologia de uma célula do tipo dois injetada com o marcador neurobiotina.

O traçador foi posteriormente visualizado por ligação à estreptavidina marcada com fluorescência, que é mostrada aqui em magenta. Abaixo, diferentes padrões de resposta de uma célula do tipo dois localizada na camada de células ganglionares à luz branca. Um estímulo prolongado de três segundos foi utilizado para melhor distinção dos componentes da resposta no estímulo, no início e no término, seguindo este procedimento.

Outros métodos, como experimentos farmacológicos, imageamento de cálcio ou imunoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o papel funcional de um determinado tipo celular na circuitaria da retina.