Name: Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprenda a registrar respostas à luz e morfologia de neurônios na retina intacta de camundongo usando excitação infravermelha de dois fótons. Esta técnica de patch-clamp direcionado permite estudar populações celulares específicas marcadas com GFP.

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Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 a KD e RW). Estamos gratos ao Euler Thomas (Töbingen, Alemanha) para o software QDS luz estimulação.

A descrição a seguir pressupõe que o pesquisador tem um conhecimento básico da estrutura da retina, patch-clamp de gravação e de microscopia de dois fótons. Para obter informações úteis sobre como estabelecer e executar uma instalação de patch-clamp e dois fótons sistema de imagem veja referências [7-12]. 1. Animal e de preparação dos tecidos <ol><li> Mantenha rato de adaptação ao escuro por pelo menos 3 h. Nesse meio tempo, prepare 1-2 l de solução extracelular consistindo de (em mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glicose e equilibrar-o para pH 7,4 por gás com carbogênio (5% de CO 2 em O 2) em temperatura ambiente. </li> um <li> Euthanize o mouse em uma câmara hermética de CO 2 overdose seguido por deslocamento cervical. Este procedimento e os seguintes passos devem ser realizados na escuridão. Use iluminação de longo comprimento de onda dim (que bloquear comprimentos de onda curtos a partir de uma fonte de luz fria por um 690 nm-longpass filtro) para apoiar a visão pessoal, mantendo os olhos do animal de adaptação ao escuro (ratos só têm má visão na parte vermelha do espectro de luz). Para o trabalho na iluminação completa escuridão usar infravermelho (&gt; 800 nm) e usar óculos de visão noturna. </li><li> Enuclear olhos com um par de tesouras curvas íris e transferi-los para um prato de solução extracelular colocadas sob um microscópio de dissecação. </li><li> Remover da córnea e do corpo ciliar, abrindo o bulbo do olho ao longo da ora serrata (a fronteira entre a retina eo corpo ciliar) com uma tesoura de mola (nós usamos primeiro uma lanceta para furar um ponto de partida para o corte). Retire a lente e separe cuidadosamente a retina do epitélio pigmentar. Se a orientação da retina é crucial para o seu estudo, indicam que, como na Ref. [12]. Cortar o nervo óptico entre retina e epitélio pigmentar da retina e remover a partir do ocular. Observe a direção das superfícies da retina: o interior da retina enrolado-up é o Ganglion lado célula; o exterior é o lado fotorreceptoras. </li><li> Remover o vítreo da superfície interna da retina, puxando-o fora com o auxílio de um palito de madeira. Para este fim, use um pequeno volume de solução extracelular que apenas cobre a retina. As varas do vítreo para o palito e podem ser arrastados centrifugamente fora da retina. Em seguida, aplique incisões curtas ao longo do perímetro da retina para facilitar o nivelamento do tecido. </li><li> Transferir a retina para dentro da câmara de gravação fotorreceptoras voltada para baixo, estendeu-o no fundo de vidro (usamos um pincel fino) e imobilizá-lo com um quadro de nylon amarrado de aço inoxidável. Prepare a retina segundo da mesma maneira e mantê-lo de adaptação ao escuro em solução extracelular carboxygenated para uso posterior. </li></ol> 2. Gravações <ol><li> Instalar a câmara de gravação na escuridão sob um microscópio a laser na vertical digitalização e superfuse a preparação da retina continuamente (não inferior a 5 ml / min) com solução extracelular carboxygenated aquecida a 35 ° C. O microscópio (também equipado com uma câmera CCD infravermelho-sensível) está situado em um choque de absorção de mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday para eletrônicos de proteção. Cobrir a gaiola com uma cortina não transparente para manter a preparação em trevas. Nós também fora da tela a luz de monitores de computador por película transparente vermelho. </li><li> Ajustar o laser infravermelho para 850-870 nm ou comprimentos de onda maiores, alterne para modo bloqueado condição e utilização de dois fótons de excitação para visualizar células que expressam GFP. Atenuar a saída do laser usando filtros de densidade neutra controlada pelo software de digitalização a laser até um grau que é apenas suficiente para o reconhecimento claro da célula fluorescentes </li><li> Para patch-clamp gravações em grampo atual modo de usar micropipetas de vidro (utilizamos tubos de vidro de borosilicato de 1,5 mm de diâmetro externo e espessura da parede 0,225 mm) preenchidas com solução intracelular consistindo de (em mM) 125 K gluconato, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titulada para pH 7,4 com KOH (dando uma resistência pipeta de cerca de 5 mohms). Note-se que outras condições experimentais como tensão-clamp gravação requer uma solução diferente. Se injeções de corante são desejados, adicione uma sonda fluorescente (nós usamos 10 mM Alexa Fluor 594) ou uma molécula marcador (3% Neurobiotin). Insira o micropipeta no suporte e certifique-se que o eletrodo de referência (fio de prata clorada) está em contato com a solução extracelular na câmara de gravação. </li><li> Aplicar pressão ao micropipeta e alvo de uma expressando GFP-célula (usamos um de 40 vezes objetiva de imersão em água; NA 1,25). Corpos celulares amácrinas estão situados na camada de células ganglionares (diretamente abaixo da superfície na orientação atual da retina), bem como na parte proximal da camada nuclear interna (cerca de 55-75 mM profundamente dentro da preparação). Antes de micropipeta contato com a célula-alvo, a membrana limitante interna (a bainha feita de glial endfeet) na retinasuperfície tem de ser penetrada. Penetração bem sucedida é reconhecida pela solução intracelular que é expulso da ponta micropipeta e destaca a membrana limitante interna da retina ao tecido subjacente como pode ser observado em uma imagem de transmissão infravermelha capturada pela câmera IR-CCD. </li><li> Abordagem a célula desejada, comparando a posição soma a partir da imagem de dois fótons com a imagem da câmera CCD IR-mostrando a posição da micropipeta de gravação. Note que este passo não é fácil, e exige alguma prática, porque a célula expressando GFP-tem que ser reconhecida na imagem de transmissão infravermelha, a fim de direcionar a micropipeta em direção a ela. Direcionamento correto é alcançado quando a ponta da micropipeta causa ondulações na superfície da célula que pode ser visto na imagem de dois fótons. Alternativa a este procedimento, use um corante fluorescente (por exemplo Alexa Fluor 594, 100 mM) na solução intracelular para revelar a posição micropipeta na imagem de dois fótons. Dois fótons excitação infravermelho permite fluorescência suficiente deste corante para fazer a micropipeta discernível. Para este fim, ajustar o alcance de detecção do software de digitalização a laser para cobrir também a fluorescência vermelha. </li><li> Libertação de pressão da micropipeta e obter uma célula inteira configuração de patch-clamp clamp na corrente de modo. Uma gravação utilizável deve dar um potencial de membrana de -50 a -55 mV e durar pelo menos 20 min. </li><li> Apresentar estímulos visuais criados por um software de estimulação (usamos QDS por Thomas Euler, da Universidade de Tübingen, Alemanha) 11 em um monitor de computador. Ajuste a posição espacial do estímulo a ser centralizado na célula registrados: Mark a posição da célula no monitor que mostra a imagem de transmissão da câmera CCD e IR-centro de um estímulo como o local para ele. Sintonize a intensidade do estímulo através da inserção de filtros de densidade neutra para o caminho do feixe. Para a calibração do espectro monitorar e intensidade ver Ref. [14]. Escolha um prolonged interstimulus intervalo (por exemplo, 15 s) para evitar a adaptação. Incluem um fotodiodo no caminho do feixe de manter registro do tempo de estímulo. </li><li> Iniciar o protocolo de estimulação e gravar as respostas luz (nós usamos uma taxa de amostragem de 10 kHz com filtragem de 5 kHz para não-spiking células; para gravação spike uma maior taxa de amostragem de 20 kHz, como é recomendado). Use o software de estímulo de luz para ativar o software de gravação. </li><li> Para deixar o corante preenchendo difusa agente fluorescente na célula gravada por 30-45 min antes cuidadosamente retração da micropipeta da célula. Tome cuidado para não retirar o corpo da célula. Se o não-traçador fluorescente Neurobiotin foi usado, ele precisa de visualização por ligação a estreptavidina conjugada a um fluoróforo (usamos estreptavidina-Cy3, 1:400 durante a noite a 4 ° C após 20 min paraformaldeído fixação da retina; para a tintura de acoplamento estudos de incubação estreptavidina pode ser prolongado para 3 d). Alternativamente, as injeções também pode ser realizada comeletrodos pontiagudos (&gt; 100 mohms) quando o corante é conduzido para dentro da célula iontophoretically empalado (pulsos retangulares: 0,25-1 nA, 100 ms, intervalo de 100 ms, o tempo total 06/03 min). </li></ol> 3. Resultados representativos: Os seguintes resultados provêm de um estudo sobre um rato que expressam a proteína verde fluorescente (GFP), sob o promotor de tirosina hidroxilase 13,14, a enzima que catalisa a taxa de etapa limitante na síntese de catecolaminas (TH:: GFP mouse). Com base no brilho da GFP sinal de duas populações celulares distintas são distinguíveis (Figura 2A). Células que expressam o nível mais elevado GFP possuem corpos celulares localizados na camada nuclear interna (INL, Figura 2A) ou deslocadas na camada de células ganglionares (GCL, Figura 2B) e estratificar no meio da camada plexiforme interna (IPL, figura 2C) . Eles foram identificados como tipo 2 células 14-16 e poderia ser sistematicamente estudada em relação à morfologia (Figura 3) e elegeratividade rical (Figura 4), ​​embora sua densidade populacional só equivale a 250 células / mm 2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Representação esquemática da instalação experimental. Dois fótons de excitação (caminho da luz vermelha pontilhada) de células que expressam fluoróforo na retina intacta permite visuais segmentação por uma micropipeta (verde caminho emissão de luz). A retina é submetido a estímulos ópticos projetados através do condensador do microscópio (caminho da luz amarela), e as respostas celulares a luz são registradas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. GFP-células que expressam em uma flatmount retina de um TH:: mouse GFP. Duas populações pode ser distinguido pelo brilho da GFP sinal: tipo 1 (células DA) localizada no INL mostrando fluorescência fraca (A, ver pontas de seta) e tipo 2 células intensamente marcadocom corpos celulares tanto no INL (A, ver setas) ou deslocadas na GCL (B) e uma estratificação dendrítica no estrato S3 do IPL (C). Barras de escala, 50 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Morfologia de uma célula do tipo 2 injetado com o Neurobiotin marcador. O traçador foi posteriormente visualizado por estreptavidina-Cy3 binding (magenta). A micrografia, que também está representando o sinal de GFP (verde), é uma projeção de pilhas de imagens cobrindo o GCL e IPL. Barra de escala, 50 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Respostas luz de uma célula do tipo 2 localizado na GCL. Padrão de resposta ao branco iluminação de campo total de luz de intensidade crescente na faixa escotópica. Intensidade do estímulo é dado em photoisomerizations por haste por segundo (Rh * / rod / s). Um estímulo prolongado de 3 s foi usado para uma melhor distintosíon dos componentes de resposta no início do estímulo (ON resposta) e offset (OFF resposta).

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</ol>

Camundongos foram tratados e sacrificados, em conformidade com as diretrizes institucionais para bem-estar animal e as leis em experimentos com animais emitidos pelo governo alemão.

Este método oferece a possibilidade de estudar as propriedades elétricas de neurônios específicos na retina intacta sob orientação visual, sem influenciar a condição de adaptação da retina. É particularmente adequado para a caracterização de células que estão actualmente bastante mal estudada, devido à baixa densidade populacional como a maioria das populações de células amácrinas. Dois fótons excitação permite imagens de alta resolução e alto contraste até mesmo de partes mais profundas do tecido 17, um pré-requisito para uma mira precisa e bem sucedida patch-fixação de células particularmente no INL, com sua alta densidade de corpos celulares. A retina do rato isolada é viável para 3-4 h nas condições experimentais. Se a retina segundo é armazenado em completa escuridão sob gaseamento carbogênio contínua, mantém a cor púrpura do fotopigmento crus e pode ser usado depois de terminar experimentos com a retina em primeiro lugar. No início, visando acélulas selecionado com a micropipeta na wholemount da retina é um pouco desafiador e requer alguma prática, especialmente quando se trabalha na escuridão. Incluindo um corante fluorescente na micropipeta pode simplificar o procedimento, porque celular e micropipeta são visíveis sob dois fótons de excitação, ao mesmo tempo. No entanto, a adição de componentes à solução intracelular podem impedir a formação de gigaseal ou causar a qualidade de gravação a sofrer. Uma vez alcançado com sucesso, uma boa gravação pode durar cerca de 1 h. Considerando que a luz de excitação infravermelho si só é mal absorvido por fotorreceptores da retina, animado células que expressam GFP emite luz na parte visível do espectro. No entanto, fluoróforos está animado apenas em um pequeno volume focal que não é susceptível de alterar a condição de adaptação da retina. Ainda mais excitação, só é necessária para segmentação e pode ser desligado durante a gravação de respostas luz. O usefulness desta abordagem já está demonstrada por estudos em populações específicas de células amácrinas 14,18 a partir do qual as gravações eletrofisiológicas de outra forma teria sido possível apenas por acidente 12. Finalmente, esta poderosa técnica pode ainda ser prorrogado, incluindo uma abordagem farmacológica 14, Ca 2 + 19 ou imagem usando células injetadas para estudos imunocitoquímicos ou microscopia eletrônica. Dessa forma, a posição funcional de um dado tipo de célula no circuito da retina podem ser desvendados.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / equipamentos de </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Óculos de visão noturna </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Alemanha </td><td> Xtron F1 </td><td> inclui uma fonte de luz 800 nm </td></tr><tr><td> Filtro óptico </td><td> Schott, Mainz, Alemanha </td><td> RG9 </td><td> longpass filtro com corte em 690 nm </td></tr><tr><td> Iris tesoura </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 14061-09 </td><td> curvo com 22 milímetros de lâmina </td></tr><tr><td> Tesoura primavera </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15000-00 </td><td> em linha reta com 3 milímetros de lâmina </td></tr><tr><td> Câmara de gravação </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Alemanha </td><td> 200-100 500 0180 Tipo A (CT) </td><td> Teflon câmara com fundo montado lamínula de vidro (aprox. 0,15 mm; n º 2-100 500 0182) </td></tr><tr><td> Aquecedor de fluxo </td><td> Sistemas de multicanal, Reutlingen, Alemanha </td><td> PH01, TC01 </td><td> cânula de perfusão aquecido com a temperatura scontrolador de Ensor e temperatura </td></tr><tr><td> Microscópio de varredura a laser </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> controlada pelo Software Leica Confocal </td></tr><tr><td> Air tabela </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> Modo bloqueado tsunami Ti: safira de laser </td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> pco AG, Kelheim, Alemanha </td><td> PixelFly QE </td><td> incluindo software de controle </td></tr><tr><td> Micropipeta capilares de vidro </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Alemanha </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> corante fluorescente </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> não traçador fluorescente </td></tr><tr><td> Estreptavidina-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Alemanha </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> motorizada Mini25 unidade manipulador com display SM-5 </td></tr><tr><td> Amplificador de patch-clamp </td><td> npi electronic GmbH, Tamm, Alemanha </td><td> SEC-05LX npi </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> De aquisição de dados software WinWCP </td><td> John Dempster, University of Scotland, Glasgow, Reino Unido </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> QDS gerador de estímulo visual </td><td> Thomas Euler, da Universidade de Tübingen, Alemanha </td><td></td><td> tem que ser operado em um computador separado controlar dois monitores (interface do usuário, estímulo monitor) </td></tr><tr><td> Os filtros de densidade neutra </td><td> ITOS, Mainz, Alemanha </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização eletrofisiológica de gfp-expressando populações de células na retina intacta

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Estudar as propriedades fisiológicas e conexões sinápticas de neurônios específicos no tecido intacto é um desafio para as células que evidente falta características morfológicas ou mostrar uma baixa densidade populacional. Isso vale principalmente para células amácrinas da retina, uma classe de interneurônios excepcionalmente multiformes que compõem cerca de 30 subtipos em mamíferos 1. Apesar de ser uma parte crucial do processamento visual, moldando a saída da retina 2, a maioria desses subtipos não foram estudadas até agora em um contexto funcional, pois encontrar essas células com um eletrodo de gravação é um evento raro. Recentemente, uma infinidade de linhas de camundongo transgênico que está disponível marcadores fluorescentes expressar como a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle de promotores de receptores de membrana ou enzimas que são específicos para apenas um subconjunto de neurônios em um dado tecido 3,4. Estas células pré-rotulados são, portanto, accessible para microeletrodo dirigido segmentação sob controle microscópico, permitindo o estudo sistemático de suas propriedades fisiológicas in situ. No entanto, a excitação de marcadores fluorescentes é acompanhada pelo risco de fototoxicidade para o tecido vivo. Na retina, esta abordagem é adicionalmente prejudicada pelo problema que a luz de excitação faz com que a estimulação adequada dos fotorreceptores, assim, infligir fotopigmento branqueamento e transferência dos circuitos da retina em uma condição de luz adaptado. Estas desvantagens são superadas usando excitação infravermelho entregue por um mode-locked laser em pulsos curtos da faixa de femtossegundos. Excitação de dois fotões fornece energia suficiente para a excitação fluoróforo e, ao mesmo tempo restringe a excitação a um pequeno volume de tecido a minimização dos perigos de photodamage 5. Além disso, ele deixa a retina sensíveis aos estímulos visuais desde a luz infravermelha (&gt; 850 nm) só é mal absorvido pelo fotopigmentos 6. em gravações situ de células que expressam GFP que são visualmente alvo de dois fótons excitação. A retina é preparada e mantida no escuro e pode ser submetido a estímulos ópticos, que são projetadas através do condensador do microscópio (Figura 1). Patch-clamp gravação de respostas a luz pode ser combinado com a tintura de enchimento para revelar a morfologia e para verificar se há corante gap-junction mediada acoplamento para as células vizinhas, de modo que a célula-alvo pode por estudadas em diferentes níveis experimental.

Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Estudar as propriedades fisiológicas e as conexões sinápticas de neurônios específicos no tecido intacto é um desafio para aquelas células que carecem de...

O objetivo geral deste procedimento é estudar as respostas à luz e a morfologia de neurônios individuais na retina intacta, utilizando uma linhagem de camundongos que expressa um marcador fluorescente exclusivamente em tipos celulares específicos. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do olho para obter uma retina isolada. O segundo passo consiste em posicionar a retina sob um microscópio de varredura a laser e visualizar uma célula por excitação infravermelha de dois fótons.Uma micropipeta é então utilizada para obter uma configuração de grampo de membrana em modo de célula inteira para gravação e preenchimento com corante. Em última análise, este preparo permite o registro de respostas celulares à estimulação fotônica e revela a morfologia da célula gravada por meio de microscopia confocal. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o grampo de membrana não guiado na retina, é que o registro pode ser direcionado visualmente a uma célula marcada com fluorescência sem estimular a retina com luz de excitação.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na pesquisa da retina, como qual é a contribuição de uma determinada população celular no processamento da informação visual? Mesmo que a população celular tenha baixa densidade e não possua características morfológicas distintas que possam facilitar a identificação. Inicie este experimento adaptando o camundongo no escuro por pelo menos três horas antes do experimento.Enquanto isso, prepare a solução extracelular conforme descrito no manuscrito anexo e borbulhe com carbogênio à temperatura ambiente. Em seguida, sacrifique o camundongo e enucleie os olhos com uma tesoura de íris curva. Transfira-os para um recipiente contendo solução extracelular.Em seguida, coloque-o sob um microscópio estereoscópico com um par de tesouras de mola. Remova a córnea e o corpo ciliar abrindo o bulbo ocular ao longo da ora serrata. Retire a lente e separe cuidadosamente a retina do epitélio pigmentado.Em seguida, corte o nervo óptico entre a retina e o epitélio pigmentado. Remova a retina da cúpula ocular. Observe que o lado interno da retina enrolada é o lado das células ganglionares.O lado externo é o lado dos fotorreceptores. Em seguida, remova o vítreo da superfície retiniana interna puxando-o suavemente com a ajuda de um palito de dente de madeira. Então, aplique pequenas incisões ao longo do perímetro da retina para facilitar o achatamento do tecido.Em seguida, transfira a retina para a câmara de registro com o lado dos fotorreceptores voltado para baixo. Espalhe-a suavemente no fundo de vidro com um pincel fino e imobilize-a com um quadro de aço inoxidável com fios de náilon. Coloque a câmara de registro no escuro sob um microscópio ereto de varredura a laser.Superfunda continuamente o preparado retiniano a uma taxa de pelo menos cinco mililitros por minuto. Com solução extracelular oxigenada a base de CO₂ aquecida a 35 graus Celsius, o microscópio está situado sobre uma mesa pneumática amortecedora de choques dentro de uma gaiola de Faraday. Para proteção eletrônica, cubra a gaiola com uma cortina opaca para manter o preparado em escuridão.Também bloqueamos a luz proveniente de monitores de computador usando filmes transparentes vermelhos. Ajuste o laser de infravermelho para 850 a 870 nanômetros ou comprimentos de onda mais longos. Alterne para a condição de bloqueio de modo e utilize excitação por dois fótons para visualizar células que expressam GFP.Para a gravação em configuração de patch clamp, preencha micropipetas de vidro borossilicato com a solução intracelular contendo uma sonda fluorescente conforme descrito no manuscrito acompanhante. Em seguida, insira a micropipeta no suporte. Certifique-se de que o eletrodo de referência esteja em contato com a solução extracelular na câmara de gravação.Em seguida, aplique pressão ao micropipeta sobre uma célula que expressa GFP utilizando um objetivo de imersão em água de 40 vezes. Os corpos celulares ômicos estão localizados na camada de células ganglionares, bem como na parte proximal da camada intercalar, antes de o micropipeta entrar em contato com a célula-alvo e penetrar a membrana limitante interna na superfície da retina. A penetração bem-sucedida é reconhecida pela solução intracelular que é expelida pela ponta do micropipeta e pelo descolamento da membrana limitante interna do tecido retiniano subjacente. O corante fluorescente na solução intracelular pode revelar a posição do micropipeta na imagem de dois fótons enquanto se aproxima da célula desejada.Em seguida, libere a pressão do micropipeto e obtenha uma configuração de grampo de membrana em célula inteira. No modo de grampo de corrente, uma gravação utilizável deve apresentar um potencial de membrana de menos 50 a menos 55 milivolts e durar pelo menos 20 minutos. Depois disso, apresente os estímulos visuais criados em um monitor de computador.Ajuste a intensidade do estímulo inserindo filtros de densidade neutra no trajeto do feixe e regule a posição espacial do estímulo para o centro da célula registrada. Em seguida, inicie o protocolo de estimulação e registre as respostas à luz. Utilize o gerador de estímulos para acionar o software de registro.Inclua um fotodiodo no trajeto do feixe para registrar o tempo do estímulo. Tenha cuidado para não puxar o corpo celular ao retrair a micropipeta. Quando realizado para preenchimento com corante, deixe o agente fluorescente difundir-se na célula registrada por 30 a 45 minutos.Aqui é apresentado um exemplo de células que expressam GFP em um preparado plano da retina sob seu promotor para a tirosina hidroxilase, onde duas populações podem ser distinguidas pela intensidade do sinal de GFP. As células dopaminérgicas do tipo um, localizadas na camada interplexiforme, expressam fluorescência fraca, conforme indicado pelas cabeças de seta. Na figura A. As células do tipo dois foram intensamente marcadas e possuem corpos celulares localizados na camada, conforme indicado pelas setas na figura A, ou deslocados na camada de células ganglionares, conforme mostrado na figura B. A figura C mostra a estratificação dendrítica das células do tipo dois no estrato três da camada plexiforme interna; aqui é apresentado um exemplo da morfologia de uma célula do tipo dois injetada com o marcador neurobiotina.O traçador foi posteriormente visualizado por ligação à estreptavidina marcada com fluorescência, que é mostrada aqui em magenta. Aqui estão diferentes padrões de resposta de uma célula do tipo dois localizada na camada de células ganglionares à luz branca. Um estímulo prolongado de três segundos foi utilizado para melhor distinção dos componentes da resposta no estímulo, no início e no término, seguindo este procedimento.Outros métodos, como experimentos farmacológicos, imageamento de cálcio ou imunoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o papel funcional de um determinado tipo celular na circuitaria da retina.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Estudando a excitabilidade de neurônios fluorescentes usando um grampo de patch de célula inteira

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

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