Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

Este experimento tem como objetivo medir diretamente a atividade formadora de acetato da acetato quinase. Inicie a reação adicionando a enzima a uma mistura reacional contendo os substratos acetil fosfato e DP. Em seguida, adicione hidroxilamina hidrocloreto para converter o acetil fosfato remanescente em acetil hidroxilato.

Adicione a solução reveladora para converter o acetil hidroxilato em um complexo colorido de hidroxilato férrico que pode ser medido espectrofotometricamente. Com base na quantidade de substrato de acetil fosfato consumido na reação, os resultados permitem a determinação dos parâmetros cinéticos da enzima. A vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela se baseia na medição direta do consumo de acetil fosfato, em vez do desacoplamento da produção de TP à redução de um ADP. Como este ensaio não depende da produção de TP, pode ser utilizado para um novo grupo de acetato quinases, que produzem fosfato de poder em vez de TP. Para uma curva padrão de seis a oito pontos, dilua a solução estoque de acetil fosfato em triss 100 milimolar até um volume final de amostra de 300 microlitros; inclua também uma amostra controle sem acetil fosfato. Equilibre todas as amostras em um bloco aquecedor a 37 graus Celsius por um minuto.

Agora, adicione 50 microlitros de hidroxilamina cloridrato dois molar, misture agitando três vezes e incube em bloco térmico a 60 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução reveladora, misture agitando três vezes e deixe a cor se desenvolver por pelo menos um minuto à temperatura ambiente. Centrifugue as amostras utilizando cubetas plásticas para o espectrofotômetro.

Meça as amostras em 540 nanômetros. Prossiga para gerar uma curva padrão de absorbância em 540 nanômetros versus micromols de acetil fosfato utilizando software apropriado de análise de dados e geração de gráficos. Calcule o valor de r quadrado.

Distribua alíquotas de 300 microlitros da mistura de reação em tubos de microcentrífuga. Lembre-se de incluir uma reação controle sem enzima e equilibre os tubos por um minuto a 37 graus Celsius. Se várias reações forem realizadas, adicione a enzima aos tubos em intervalos de tempo específicos e retorne imediatamente cada tubo ao bloco térmico a 37 graus Celsius.

Após cinco minutos, adicione 50 microlitros de hidroxilamina cloridrato dois molares, misture e incube por cinco minutos a 60 graus Celsius. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de desenvolvimento, misture e deixe em temperatura ambiente para o desenvolvimento da cor. Em seguida, centrifugue as amostras a 18.000 × g por um minuto.

Prossiga para medir a absorbância a 540 nanômetros. Determine a quantidade de acetil fosfato presente por meio da comparação com a curva padrão de acetil fosfato. Os dados podem ser plotados e ajustados à equação de McKayla Cementin para a determinação dos parâmetros cinéticos.

Este ensaio determina o consumo do substrato acetil fosfato para medir a atividade da acetato quinase no sentido da formação de acetato. O acetil fosfato remanescente após um determinado tempo durante a reação enzimática é convertido em oxiato de acetila e, posteriormente, em um complexo férrico de hidróxi oxiato, que apresenta uma coloração avermelhada que pode ser medida a 540 nanômetros. Esta curva padrão típica, que plota a absorbância a 540 nanômetros versus micromols de acetil fosfato, possui uma inclinação de 1,2332 unidades de absorbância por micromol de acetil fosfato.

O valor resultante de r quadrado de 0,99 indica que os dados se ajustam bem à equação linear conforme representado aqui. Este ensaio pode ser usado para determinar a KM para acetil fosfato em várias preparações enzimáticas. A cinco milimolares, um DP com concentrações variáveis de acetil fosfato purificado de acetato quinase recombinante de Methanol Sarina thermophilic segue cinética padrão do tipo McKayla cementina para cada substrato, resultando em uma KM aparente de 0,27 ± 0,01 milimolar de acetil fosfato.

Diferentemente do ensaio acoplado padrão, este ensaio direto pode medir a atividade de acetato quinases que utilizam substratos diferentes de ATP. Por exemplo, na utilização de acetil fosfato pela acetato quinase de Entamoeba histolytica produtora de pirofosfato, o fosfato de sódio foi substituído por ADP na mistura de reação. A curva resultante indica um valor aparente de KM de 0,50 ± 0,006 milimolar de acetil fosfato. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como medir diretamente a atividade da acetato quinase determinando a quantidade de acetil fosfato consumida.

Um fator fundamental para obter resultados reprodutíveis é ser consistente em cada etapa, especialmente na adição da enzima e na etapa de mistura.