Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

Este experimento visa uma medida direta da atividade de formação de acetato da acetato quinase. Inicie a reação adicionando enzima a uma mistura de reação contendo os substratos acetil fosfato e um DP. Em seguida, adicione cloridrato de hidroxilamina para converter o fosfato de acetil restante em hidroxilato de acetila.

Adicione solução de desenvolvimento para converter o hidroxilato de acetila em um complexo de hidroxilato férrico colorido que pode ser medido. O espectrometria fotometricamente baseado na quantidade de substrato acetil fosfato consumido nos resultados da reação permite a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos. A vantagem desta técnica sobre os métodos existentes baseia-se na medição direta do consumo de acetilfosfato em vez do desacoplamento de uma produção de TP com a redução de um A DP. Como este ensaio não depende de uma produção de TP, ele pode ser usado para um novo grupo de acetato quinases, que produzem fosfato de potência em vez de um TP Para uma curva padrão de seis a oito pontos, dilua a solução estoque de fosfato de acetil em 100 milimolares triss para um volume de amostra final de 300 microlitros também inclua uma amostra de controle sem fosfato de acetil equilibre todas as amostras em um bloco de calor de 37 graus Celsius para Um minuto.

Agora, adicione 50 microlitros de cloridrato de hidroxilamina de dois molares, misture agitando três vezes e incube em bloco de calor a 60 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros de mistura de solução de revelação agitando três vezes e deixe a cor se desenvolver por pelo menos um minuto em temperatura ambiente. Centrifugar as amostras com cubetas de plástico para o espectrofotómetro.

Meça as amostras em 540 nanômetros. Prossiga para gerar uma curva padrão de absorbância a 540 nanômetros versus micromoles de acetil fosfato com análise de dados apropriada e software gráfico. Calcule o valor de r ao quadrado.

Distribua alíquotas de 300 microlitros de mistura de reação para tubos de microcentrífuga. Lembre-se de incluir uma reação de controle sem tubos de equilíbrio enzimático por um minuto a 37 graus Celsius. Se várias reações forem realizadas, adicione enzima aos tubos em intervalos de tempo específicos e retorne imediatamente cada tubo ao bloco de calor de 37 graus Celsius.

Após cinco minutos, adicione 50 microlitros de cloridrato de hidroxilamina de dois molares, misture e incube cinco minutos a 60 graus Celsius. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de revelação, misture e coloque em temperatura ambiente para o desenvolvimento da cor. Em seguida, centrifugue amostras a 18.000 vezes G por um minuto.

Prossiga para medir a absorbância em 540 nanômetros. Determine a quantidade de acetil fosfato presente em comparação com a curva padrão de acetil fosfato. Os dados podem ser plotados e ajustados à equação de McKayla Cementina para determinação de parâmetros cinéticos.

Este ensaio determina o consumo do substrato de acetil fosfato para medir a atividade da acetato quinase na direção da formação do acetato. O fosfato de acetila remanescente após um determinado tempo durante a reação enzimática é convertido em acetil oxibato e, posteriormente, em complexo hidroxilado férrico, que tem uma cor avermelhada que pode ser medida em 540 nanômetros. Esta curva padrão típica plotando a absorbância a 540 nanômetros versus fosfato de acetil micromoles tem uma inclinação de 1,2332 unidades de absorbância por fosfato de acetil micromole.

O valor r quadrado resultante de 0,99 indica que os dados se encaixam bem com a equação linear conforme ilustrado aqui. Este ensaio pode ser usado para determinar o KM para fosfato de acetil para várias preparações enzimáticas. A cinco milimolares um DP com concentrações variadas de acetil fosfato de acetil quinase recombinante purificado de metanol Sarina termofílico segue a cinética padrão de citrina McKayla para cada substrato, resultando em um KM aparente de 0,27 mais ou menos 0,01 milimolar acetil fosfato.

Ao contrário do ensaio acoplado padrão, este ensaio direto pode medir a atividade de acetato quinases que utilizam substratos diferentes de um TP. Por exemplo, na utilização de acetil fosfato pela pirofosfato produzindo acetato quinase inba histolytica, o fosfato de sódio foi substituído por um DP na mistura de reação. A curva resultante indica um valor aparente de KM de 0,50 mais ou menos 0,006 milimolar acetil fosfato. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia sobre como medir a atividade da acetato quinase diretamente, determinando a quantidade de acetil fosfato consumida.

Um fator chave na obtenção de resultados reprodutíveis é ser consistente em cada etapa, especialmente na adição de enzima e na etapa de mistura.