Name: Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda o ensaio de pull-down de calmodulina para estudar interações proteicas dependentes de cálcio usando células eucarióticas. Este método identifica proteínas ligantes de CaM e elucida vias de sinalização celular em neurociência.

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Os autores gostariam de agradecer a Tiffany Cereja em sua ajuda na otimização deste protocolo. Este trabalho foi financiado pelo National Institute of Aging (AG032320), bem como Avançando um Wisconsin saudável.

Consulte a Figura 1 para um esquema básico do início procedimento com o homogeneizado. Tempo estimado desde a preparação de extratos celulares para eluição de Cam-bound proteínas é de cerca de 6-7 horas. 1. Preparação dos tecidos <ol><li> Injetar organotípicas fatias do hipocampo com um vírus que contém um plasmídeo expressando a proteína recombinante de interesse (neste exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) marcadas Ng) e permitir que o tecido que expressam a proteína durante a noite. </li><li> Cerca de 12 a 18 horas após a injeção viral (dependendo da época expressão viral), prepare-se para coletar o tecido. Adicionar tampão dissecção 1mL (glicose 10mM, KCl 4 mM, NaHCO3 26mm, sacarose 233mM, MgCl 5mM 2, 1 mM CaCl 2, e 0,1% de fenol-vermelho, gaseados com 5% de CO 2 95% O 2) a uma placa de Petri. Transferência de tecido cultivado / inserir a placa de Petri e adicionar 2 ml de buffer dissecção para a inserção de submergir o tecido. </li><li> Coletat organotípicas tecido do hipocampo (entre 5 e 10 fatias) delicadamente raspando o tecido livre da membrana inserção utilizando um bisturi. Especificamente a remoção de uma determinada região de interesse (por exemplo, CA1) também é uma opção. Transferência de suspensão do tecido para um tubo de microcentrífuga 1,5 ml usando uma pipeta Pasteur invertida. </li><li> Centrifugar amostras em 1500 rcf para 1 min para separar tecido do tampão dissecção. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Para cada fatia usada, adicione 30-60 mL de tampão de homogeneização (150mm NaCl, 20mM Tris pH 7.5, 1mM DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL Antipaína, pepstatin 1μg/mL, e 1% Triton X -100) para o tecido e homogeneizar cuidadosamente com o pilão. </li><li> , A fim de remover os restos celulares, centrifugar o homogeneizado restante em 1100 rcf durante 10 minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, evitando a contaminação do sedimento. </li><li> Ter 10% do sobrenadante como amostra da entrada (amostra 1). Guarde o sobrenadante restante no gelo durante a preparação das contas CaM-sepharose para uso no passo 3. </li></ol> Nota: O tecido utilizado aqui estão organotípicas fatias do hipocampo. No entanto, pode-se usar os neurônios dissociados ou qualquer sistema de cultura de outras células. Nesse caso, comece com a etapa 1,4 depois de coletar o tecido de maneira apropriada. 2. Preparação de grânulos de pull-down No manuseio das contas, é importante para salvar as contas e maximizar a eficiência das reações, impedindo as contas de secagem sobre os lados do tubo. Para isso, é melhor para rodar seus tubos do lado deles, permitindo que solução para molhar as contas nas paredes do tubo, imediatamente antes da centrifugação. <ol><li> Para cada pull-down, pipeta de 400 mL suspensão Calmodulina Sepharose-beads em um tubo de microcentrífuga 2 mL com um fla relativamentet-bottom para maximizar a área de superfície e interação de suas soluções com as contas durante a sua incubação. </li><li> Centrífuga contas a 21.000 rcf durante 30 segundos e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar as contas. </li><li> Para lavar as contas, adicionar 100 mL do tampão de homogeneização respectivos contendo um ou dois mM CaCl 2 para aqueles que estão sendo usados ​​para puxar para baixo Ca 2 +-CaM proteínas de ligação e 2 mM EDTA (um conhecido Ca 2 + quelante) para contas puxando para baixo ApoCaM proteínas de ligação. Bata suavemente o tubo para re-suspender contas e centrifugar a 1500 rcf para 1 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, certificando-se para não perturbar as contas. </li></ol> Nota: Para todos os passos de aspiração, é recomendado o uso de uma ponteira que tem uma abertura fina (por exemplo, dicas de carga gel) para permitir a remoção da solução sem remover contas. 3. CaM-sepharose ligação de proteínas <ol><li> Dividir o seu sobrenadante em duas condições que contenham um volume igual. Dependendo da sua condição, adicionar a quantidade apropriada de CaCl 2 ou EDTA para o sobrenadante até 2 mM para cada concentração. </li><li> Adicionar sobrenadante do passo de 1,7 a contas lavados em tampão de homogeneização correspondente. Bata suavemente o tubo para misturar. </li><li> Incubar as amostras a 4 ° C por 3 horas em uma coqueteleira. Re-suspender contas a cada 30 minutos ou mais para aumentar a eficiência da ligação. </li><li> Tubo de centrífuga contendo amostras e contas de 1500 rcf durante 3 min. </li><li> Tome 50μL do sobrenadante como amostra de proteína unbound (amostra 2) e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e restantes descartar. </li><li> Lavar contas três vezes como descrito no passo 2,3 utilizando 100μL de tampão de homogeneização respectivos. </li></ol> 4. Eluição <ol><li> Adicionar 50μL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl pH 7.5, NaCl e 150 mm), contendo a condição oposta (10mM CaCl 2 ou 10mM EDTA) para as contas. Por exemplo, as amostras que foram homogeneizadas e ligado em tampão contendo Ca 2 + são eluídos em tampão de eluição contendo EDTA e vice-versa. </li></ol> Opcional: O aquecimento do tampão de eluição a 37 ° C antes de adicionar contas pode aumentar o rendimento. <ol start="2"><li> Incubar solução com contas em temperatura ambiente por 30 min em um agitador. Misture as contas batendo o tubo a cada 5 min. </li><li> Centrífuga contas em 1500 rcf por 3 min e remova cuidadosamente a 50μL do sobrenadante para a ligação às proteínas (amostra 3) por aspiração. Certifique-se de não perturbar as contas. </li><li> Adicionar tampão de carregamento de proteína para todas as amostras (ou seja, proteínas unbound homogeneizado, e amarrou bem como aqueles que ainda estão vinculados às esferas). </li></ol> Nota: Para maximizar a eluição (especialmente no caso de eluição ineficiente), adicionar 50μL do tampão de eluição correspondentes (por exemplo, a adição de EDTA buf contendofer de contas vinculadas em CaCl 2) para as contas antes de aquecer as amostras para ajudar a eluir qualquer proteína ligada restantes e repita os passos descritos no item 4.3 para remover proteínas restantes vinculados. 5. SDS-PAGE e western blot Conduta SDS-PAGE e analisar usando western blot sondando para a sua proteína de interesse e sonda para uma proteína conhecida por se ligar CaM na condição oposta como controle positivo. 6. Resultados representante Figura 2B mostra um exemplo de um ensaio de CaM-pull-down testar a ligação da CaM GFP-tagged Ng comparação com Ng endógena. Para isso, GFP-Ng foi overexpressed em nosso organotípicas fatias do hipocampo durante a noite e o tecido foi homogeneizado. O homogenato foi incubado com CaM-sepharose contas na presença de um Ca 2 + ou EDTA. Homogenato de entrada mostra que a GFP-Ng foi expressa, além de Ng endógenos e Ca 2 + / CaM quinase II dependente de(CaMKII). Como era esperado com base na ligação conhecida de Ng endógena (ilustrado na figura. 2A), GFP-tagged Ng foi eluída na ausência de Ca 2 + (EDTA ligação às proteínas) e não ligado, na presença de Ca 2 + (Fig. 2B) . Em contraste, o controle, CaMKII, foi eluído apenas na presença de Ca 2 + (proteínas) e foi unbound na sua ausência (EDTA). Isso mostra que as contas foram CaM funcionando corretamente eo elutions foram eficientes. Mais importante, isso mostra que GFP-Ng se liga a ApoCaM de forma semelhante à forma endógena, sugerindo que a tag GFP não alterou a função da nossa proteína recombinante. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Esboço figura 1. CaM do ensaio de pull-down (A) homogeneizado de tecido é girado para baixo para remover os restos celulares. Cerca de 10% do sobrenadante é tida como uma amostra da entrada (1). O sobrenadante restante é dividido igualmente para os diferentescondições e os reagentes apropriados (CaCl 2 ou EDTA) são adicionados ao teste obrigatório em tais condições. Cada sobrenadante (contendo um ou outro CaCl 2 ou EDTA) é carregado no respectivamente preparado CaM-sepharose contas e (B) incubado para permitir a ligação. Proteínas não ligados são removidos (2) e (C) as proteínas ligados (3) são eluídos fora das esferas usando tampão de eluição (EB), contendo a condição oposta, como a ligação. A composição das proteínas dessas três amostras de proteínas podem ser analisadas utilizando SDS-PAGE e western blot. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A. esquemática) de Ca 2 + dependentes de ligação CaM e eluição em Exemplos de pull-down ensaio são dadas de dois tipos de proteínas que se ligam CaM em Ca 2 + forma-dependente. Neurogranin (Ng) representa proteínas que se ligam apo-CaM e CaMKII representa proteínas que se ligam ao Ca 2 + ricosCaM. CaM é mostrada em seu estado dissociado antes da incubação com as proteínas homogeneizado. Uma vez incubados sob condições de altas concentrações de Ca 2 + (2 mM) ou na presença de um quelante de Ca 2 +, EDTA (2 mM), as proteínas se ligam a CaM em conformidade. Ng liga CaM na condição de EDTA como há pouca ou nenhuma Ca 2 + presente, e seria eluído fora as contas CaM-sepharose na presença de Ca 2 +. CaMKII, porém, se ligariam a CaM na presença de quantidades elevadas de Ca 2 + e que dissociar uma vez que o Ca 2 + foi quelatado. B.) Os resultados de CaM exemplo pull-down ensaio. Este número demonstra o resultado final esperado de um CaM-sepharose puxar para baixo com as amostras sondado por Ng e CaMKII. Ambos Ng endógeno e GFP-Ng estão presentes nas pistas de proteínas ligados a CaM na presença de EDTA. Ng não é obrigado quando as amostras são incubadas com CaM na presença de Ca 2 +, demonstrando que Ng só liga apo-CaM. Nosso controle positivo, CaMKII, por outro lado, liga-se a CaM apenas na presença de Ca 2 +.

<ol><li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+West+Pharmacol+Soc%22%5BJournal%5D)">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li>
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<li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li>
<li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Clin.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li>
<li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin%27s+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li>
<li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo fornecido utiliza CaM-sepharose contas para investigar o Ca 2 + dependência da CaM proteínas de ligação. Muitas proteínas se ligam CaM em uma Ca 2 + forma-dependente. Essas interações são de grande importância dado o número de CaM proteínas de ligação e seu papel crítico em muitas vias de sinalização. Neste protocolo, CaM-sepharose contas são usadas para separar CaM proteínas de ligação a partir de homogeneizado de tecido na presença ou ausência de Ca 2 +. Os resultados desta...

<table border="1"><tr><td> Produto </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Calmodulina-Sepharose contas </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Dicas Pipetar Loading </td><td> Pescador </td><td> 02-707-138 </td><td> Use para aspiração de sobrenadantes </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga (2,0 mL) </td><td> Pescador </td><td> 05-408-146 </td><td> Use para todas as etapas que envolvem a calmodulina-sepharose contas </td></tr></table>

pull-down da calmodulina proteínas de ligação

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Cálcio (Ca 2 +) é um íon vital na regulação da função celular através de uma variedade de mecanismos. Muito do Ca 2 + de sinalização é mediada através da proteína de ligação de cálcio conhecido como calmodulina 1,2 (CaM). CaM está envolvido em vários níveis em quase todos os processos celulares, incluindo apoptose, o metabolismo, a contração do músculo liso, plasticidade sináptica, o crescimento do nervo, inflamação e da resposta imune. Uma série de proteínas ajudam a regular essas vias através de sua interação com CaM. Muitas dessas interações dependem da conformação da CAM, que é distintamente diferente quando ligado a Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) em oposição à sua Ca 2 + estado livre (ApoCaM) 3. Enquanto a maioria das proteínas-alvo bind Ca 2 +-CaM, algumas proteínas só se ligam a ApoCaM. Alguns ligam-se através CaM seu QI de domínio, incluindo neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, e miosinas certos <sup&gt; 6. Essas proteínas têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na função pré-sináptica 7, função pós-sinápticos 8, e 9 a contração muscular, respectivamente. Sua capacidade de ligar e liberar CaM na ausência ou presença de Ca 2 + é central na sua função. Em contraste, muitas proteínas se ligam apenas Ca 2 +-CaM e exigem esta ligação para sua ativação. Exemplos incluem a quinase da cadeia leve da miosina 10, Ca 2 + / CaM quinases dependentes (CaMKs) 11 e fosfatases (por exemplo, da calcineurina) 12, e espectrina quinase 13, que tem uma variedade de efeitos diretos e jusante 14. Os efeitos destas proteínas em função celular são muitas vezes dependentes de sua capacidade de se ligar a CaM em Ca 2 + forma-dependente. Por exemplo, testamos a relevância da Ng-CaM obrigatório em função sináptica e como diferentes mutações afetam essa ligação. Geramos uma GFP-tagged con Ngstruct com mutações específicas no IQ-domínio que iria mudar a capacidade de Ng para ligar CaM em Ca 2 + forma-dependente. O estudo destas mutações diferentes nos deu grande insight sobre processos importantes envolvidos na função sináptica 8,15. No entanto, em tais estudos, é essencial para demonstrar que as proteínas mutantes têm a ligação esperada alterado para CaM. Aqui, apresentamos um método para testar a capacidade de se ligar a proteínas CaM na presença ou ausência de Ca 2 +, usando CaMKII e Ng como exemplos. Este método é uma forma de cromatografia de afinidade referido como um ensaio CaM pull-down. Ele usa CaM-Sepharose contas para testar as proteínas que se ligam ao CaM e à influência de Ca 2 + em essa ligação. É tempo consideravelmente mais eficiente e requer menos proteínas em relação a cromatografia de coluna e outros ensaios. Ao todo, este fornece uma valiosa ferramenta para explorar Ca 2 + / CaM sinalização e proteínas que, emteract com CaM.

Calmodulina (CaM) ensaio de pull-down é uma maneira eficaz para investigar a interação de CaM com várias proteínas. Este método usa CaM-sepharose contas para análise eficiente e específica do CaM proteínas de ligação. Isto proporciona uma importante ferramenta para explorar sinalização CaM em função celular.

Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação

O cálcio (Ca2+) é um íon vital na regulação da função celular por meio de diversos mecanismos. Grande parte da sinalização de Ca2+ é mediada através do...

O objetivo geral deste procedimento é testar proteínas que se ligam à calmodulina de maneira dependente de cálcio. Isso é realizado primeiramente coletando as proteínas de interesse. Em seguida, são preparadas matrizes de calmodulina para ligação proteica.Em seguida, as proteínas são incubadas com calmodulina ligada a partículas séricas. Por fim, as proteínas que se ligam de maneira dependente de cálcio são eluídas. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram proteínas que se ligam à calmodulina na presença ou ausência de cálcio por meio de análise western blot.A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos existentes, como cromatografia em calma e imunoprecipitação, é que ela exige menos proteína e menos tempo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de sinalização da modlina bovina, como quais proteínas se ligam à modlina bovina de maneira dependente de cálcio e como modificações pós-traducionais podem afetar sua ligação à modlina bovina. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de manipulação das microesferas são cruciais e a descrição da ressuspensão e retenção das microesferas é difícil de acompanhar

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O retículo endoplasmático desempenha um papel fundamental na biogênese de proteínas e na homeostase do cálcio. Nós estabelecemos um sistema experimental que nos permite abordar o papel dos canais de Ca2 + de vazamento e para caracterizar o suposto mecanismos de regulação. Este sistema envolve siRNA silenciamento gênico mediado e de células vivas Ca2 + imagem.

Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca 2 + Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), um canal de cloreto epitelial, tem sido relatado para interagir com várias proteínas e regulam importantes processos celulares, entre eles os CFTR PDZ motivo mediadas-interacções têm sido bem documentados. Este protocolo descreve métodos desenvolvidos para montar um macromolecular CFTR PDZ-dependente sinalização...

Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

Apresentamos protocolos para a aplicação de nosso indicador de cálcio codificado geneticamente codificado (GECI) CatchER + para monitorar transientes rápidos de cálcio no retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 e células C2C12 de músculo esquelético usando microscopia de fluorescência em tempo real. Um protocolo para a medição e calibração in situ K d também é discutido.

Monitorização da libertação de cálcio ER / SR com o Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Captador<sup-benzóico.</sup

A Ação Capilar De Ligania Diferencial do Ensaio de Ligamento (DRaCALA) pode ser usada para identificar pequenas proteínas de ligação de ligantes de um organismo usando uma biblioteca ORFeome.

Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).

Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

Aqui, descrevemos um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas usando um conjunto de vetores compatíveis, seguido pelas técnicas convencionais de pulldown para estudar complexos proteicos que não podem se montar in vitro.

Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

Um protocolo aprimorado para um ensaio de mobilização de cálcio com células endoteliais, usado para identificar ligantes de receptores ativados por protease (PARs), foi desenvolvido. O novo protocolo reduz o tempo total de ensaio em 90-120 min e produz curvas de concentração-resposta reprodutíveis.

Caracterização de moduladores de receptores ativados por protease com um ensaio de mobilização de cálcio usando um leitor de placas

Neste vídeo, demonstramos um método para separação eletroforética de proteínas usando poli-acrylimide eletroforese em gel (PAGE).

Separação eletroforética de proteínas

Após a separação por métodos eletroforéticos, proteínas em um gel pode ser detectado por vários métodos de coloração. Coloração de proteínas com Coomassie Blue, coloração pela prata, Orange SYPRO, Ruby SYPRO são demonstradas neste vídeo.

Coloração Proteínas em Gel

Microcontact impressão é usado extensivamente às proteínas padrão e outras moléculas nas superfícies de materiais. Demonstramos as etapas básicas desse processo, carimbar padrões de fibronectina em vidro.

Impressão microcontact de Proteínas de Biologia Celular

Aprenda o ensaio de pull-down de calmodulina para estudar interações proteicas dependentes de cálcio usando células eucarióticas. Este método identifica proteínas ligantes de CaM e elucida vias de sinalização celular em neurociência.

Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação

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