Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação

O objetivo geral deste procedimento é testar proteínas que se ligam a Cal Modlin de maneira dependente de cálcio. Isso é feito coletando primeiro proteínas de interesse. Em seguida, as velocidades de soro da calmodulina são preparadas para a ligação às proteínas.

Em seguida, as proteínas são incubadas com velocidades sorológicas de calmodulina. Finalmente, as proteínas que se ligam de maneira dependente de cálcio são aludidas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram proteínas que se ligam à calmodulina na presença ou ausência de cálcio por meio de análise de sangue ocidental.

A principal vantagem dessa técnica em relação a outros métodos existentes, como cromatografia calma e imunoprecipitação, é que ela requer menos proteína e menos tempo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de sinalização do modlin de vaca, como quais proteínas se ligam ao modlin de vaca de maneira dependente de cálcio e como as modificações pós-traducionais podem afetar sua ligação ao modlin de vaca. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de manuseio do cordão são essenciais e a descrição da ressusa e retenção dos grânulos é difícil de seguir sem vê-la.

Para preparar o tecido para um homogêneo, injetar fatias organotípicas do hipocampo com um vírus contendo um plasmídeo que expressa a proteína recombinante de interesse. Neste exemplo, a proteína recombinante é GFP marcada como Neuro Grandin. Deixe o tecido expressar a proteína durante a noite aproximadamente 12 a 18 horas após a injeção viral, adicione um mililitro de tampão de dissecação a uma placa de Petri.

Transfira o tecido cultivado com inserto para a placa de Petri e adicione dois mililitros de tampão de dissecção ao inserto para submergir o tecido usando um bisturi. Colete de cinco a 10 fatias de tecido organotípico do hipocampo raspando suavemente o tecido da membrana de inserção com uma pipeta de pastagem invertida. Transfira o tecido suspenso para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, centrifugue as amostras a 1500 RCF durante um minuto. Para separar o tecido do tampão de dissecção, remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o pellet.

Para cada fatia usada, adicione o tecido a 30 a 60 microlitros de tampão de homogeneização com uma pipeta de um mililitro com uma ponta cortada e, em seguida, homogeneize-o completamente usando um pilão antes de retornar o homogeneizado ao seu tubo original. Para remover os detritos celulares, centrifugar o homogeneizado restante a 1100 RCF durante 10 minutos e recolher cuidadosamente o snat por aspiração, evitando a contaminação do pellet. Alíquota 10% do sobrenadante como amostra da entrada.

Armazene o sobrenadante restante no gelo durante a preparação das contas cal sero para uso. Mais tarde, para cada pipeta suspensa 400 microlitros de cal suspensa Modlin Sero acelera em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros com um fundo relativamente plano para maximizar a área de superfície e a interação das soluções com os grânulos durante as incubações, gire o tubo de microcentrífuga de lado para molhar os grânulos e, em seguida, centrifugue os grânulos a 21, 000. RCF por 30 segundos.

E remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar os grânulos para lavá-los a 100 microlitros do respectivo tampão de homogeneização contendo dois milimolares de cloreto de cálcio para grânulos sendo usados para puxar para baixo as proteínas de ligação do cálcio cal modlin. Ou dois milimolares E-D-T-A-A quelante de cálcio conhecido para grânulos sendo usados para puxar para baixo as proteínas de ligação ao modlin apocal.

Bata suavemente o tubo no Resus. Suspender os grânulos e centrifugar a 1500 RCF durante um minuto. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, certificando-se de não perturbar os grânulos para ligar as proteínas às esferas de calmodulina para puxar para baixo.

Comece dividindo o SNAT em dois volumes iguais. Em função do estado por alíquota, adicionar a quantidade adequada de cloreto de cálcio ou de EDTA ao supernat até obter uma concentração final de dois milimolares. Adicionar o sobrenadante aos grânulos lavados no tampão de homogeneização adequado.

Bata suavemente no tubo para misturar. Incubar as amostras a quatro graus Celsius durante três horas num shaker. Suspendemos as contas a cada 30 minutos ou mais para aumentar a eficiência da encadernação.

Em seguida, centrifugue as amostras a 1500 RC F por três minutos. Remova 50 microlitros de sobrenadante como uma amostra de proteína não ligada e remova cuidadosamente o snat restante por aspiração e descarte. Lave os grânulos três vezes como antes com 100 microlitros do tampão de homogeneização apropriado.

A etapa mais difícil neste procedimento é o elucian das proteínas-alvo de maneira eficiente. A melhor maneira de garantir o sucesso é usar o tipo certo de tubo para minimizar a perda de grânulos e ressuspender adequadamente os grânulos no aquecimento do tampão de eluição. O tampão de eluição de antemão também pode ajudar significativamente a eluir a proteína a 50 microlitros de tampão eluciano para as contas.

As amostras que foram homogeneizadas e ligadas em tampão contendo cálcio são aludidas em tampão contendo EDTA e as amostras que tinham tampão contendo EDTA são aludidas com cálcio. Incube as contas em temperatura ambiente por 30 minutos em uma coqueteleira. Misture as contas batendo suavemente no tubo a cada cinco minutos.

Centrifugue os grânulos a 1500 RCF por três minutos e remova cuidadosamente os 50 microlitros de SNAT para a amostra de proteína ligada por aspiração. Certifique-se de não mexer nas contas. Realize a página SDS e o western blotting para identificar a proteína de interesse como um controle positivo na condição oposta.

Proteína Prop Pro conhecida por se ligar a Cal Modlin. Esta figura mostra um exemplo de um ensaio de puxar para baixo Cal Modlin testando a ligação Cal MODLIN de GFP TAG Neuro Grandin em comparação com o neuro Grandin endógeno. A entrada homogênea mostra que a neuro Grandin GFP foi expressa além da neuro grandina endógena e da quinase dependente de calmodulina de cálcio dois, como esperado, com base na ligação conhecida da neuro Grandin endógena.

GFP marcado Neuro Grandin foi aludido na ausência de cálcio e não se ligou na presença de cálcio. Em contraste, a quinase dois dependente de calmodulina de cálcio de controle foi aludida apenas na presença de cálcio e não se ligou na sua ausência. Isso mostra que os grânulos de calmodulina estavam funcionando corretamente e a EEU era eficiente.

Mais importante ainda, isso mostra que o sorriso neuro GFP se liga ao Apoch Cal Modlin de maneira semelhante à forma endógena, sugerindo que a etiqueta GFP não alterou a função de uma proteína recombinante. Uma vez dominada esta técnica, não incluir a página SDS e a análise de sangue ocidental pode ser concluída em seis horas quando feita corretamente Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de rotular todas as amostras e tubos para a condição apropriada, pois qualquer alteração na concentração de cálcio pode comprometer todo o experimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar com eficiência a capacidade de proteínas específicas de se ligarem a um módulo CAL de maneira dependente de cálcio.

Coletando as proteínas de interesse, incubando-as com as velocidades SRO comodulantes adequadamente preparadas, iludindo as proteínas ligadas e testando-as usando análise de sangue ocidental.