Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação

O objetivo geral deste procedimento é testar proteínas que se ligam à calmodulina de maneira dependente de cálcio. Isso é realizado primeiramente coletando as proteínas de interesse. Em seguida, são preparadas matrizes de calmodulina para ligação proteica.

Em seguida, as proteínas são incubadas com calmodulina ligada a partículas séricas. Por fim, as proteínas que se ligam de maneira dependente de cálcio são eluídas. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram proteínas que se ligam à calmodulina na presença ou ausência de cálcio por meio de análise western blot.

A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos existentes, como cromatografia em calma e imunoprecipitação, é que ela exige menos proteína e menos tempo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de sinalização da modlina bovina, como quais proteínas se ligam à modlina bovina de maneira dependente de cálcio e como modificações pós-traducionais podem afetar sua ligação à modlina bovina. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de manipulação das microesferas são cruciais e a descrição da ressuspensão e retenção das microesferas é difícil de acompanhar sem vê-los.

Para preparar o tecido para cortes orgânicos hipocampais injetados de forma homogênea com um vírus contendo um plasmídeo que expressa a proteína recombinante de interesse. Neste exemplo, a proteína recombinante é Neuro Grandin marcada com GFP. Deixe o tecido expressar a proteína durante a noite, aproximadamente 12 a 18 horas após a injeção viral, adicione um mililitro de tampão de dissecção a uma placa de Petri.

Transfira o tecido cultivado com o inserto para a placa de Petri e adicione dois mililitros de tampão de dissecção ao inserto para submergir o tecido usando um bisturi. Colete cinco a 10 fatias de tecido hipocampal organotípico raspando suavemente o tecido livre da membrana do inserto com uma pipeta Pasteur invertida. Transfira o tecido suspenso para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.

Em seguida, centrifugue as amostras a 1500 RCF durante um minuto. Para separar o tecido do tampão de dissecção, remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o pellet.

Para cada fatia utilizada, adicione o tecido a 30 a 60 microlitros de tampão de homogeneização com uma pipeta de um mililitro com ponteira cortada e, em seguida, homogeneíze-o completamente usando um pistilo antes de devolver o homogeneizado ao seu tubo original. Para remover os detritos celulares, centrifugue o homogeneizado restante a 1100 RCF durante 10 minutos e colete cuidadosamente o snat por aspiração, evitando contaminação pelo pellet. Aliquote 10% do sobrenadante como uma amostra do input.

Guarde o sobrenatante remanescente em gelo durante a preparação das esferas de cal soro para uso. Posteriormente, para cada precipitação, pipete 400 microlitros das esferas de cal modlin sero suspensas em um tubo microcentrífugo de dois mililitros com fundo relativamente plano para maximizar a área de superfície e a interação das soluções com as esferas durante as incubações, gire o tubo microcentrífugo de lado para umedecer as esferas e, em seguida, centrifugue as esferas a 21.000 RCF por 30 segundos.

E remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar as esferas para lavar as esferas com 100 microlitros do respectivo tampão de homogeneização contendo ou dois milimolares de cloreto de cálcio para as esferas utilizadas para precipitar proteínas ligadoras de cálcio calmodulina. Ou dois milimolares de A-D-T-A-E, um quelante conhecido de cálcio, para as esferas utilizadas para precipitar proteínas ligadoras de apocalmodulina.

Toque suavemente no tubo para ressuspender. Suspenda as esferas e centrifugue a 1500 RCF durante um minuto. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, certificando-se de não perturbar as esferas para ligar as proteínas à calmodulina esférica para o ensaio de precipitação.

Inicie dividindo o SNAT em dois volumes iguais. Dependendo da condição por alíquota, adicione a quantidade apropriada de cloreto de cálcio ou EDTA ao sobrenadante para atingir uma concentração final de dois milimolares. Adicione o sobrenadante às esferas lavadas no tampão de homogeneização apropriado.

Toque suavemente no tubo para misturar. Incube as amostras a quatro graus Celsius por três horas em agitador. Suspenderemos as microesferas a cada 30 minutos, mais ou menos, para aumentar a eficiência da ligação.

Em seguida, centrifugue as amostras a 1500 RC F durante três minutos. Remova 50 microlitros do sobrenadante como amostra da proteína não ligada e remova cuidadosamente o snat remanescente por aspiração, descartando-o. Lave as microesferas três vezes como anteriormente com 100 microlitros do tampão de homogeneização apropriado.

O passo mais difícil deste procedimento é a eluição eficiente das proteínas-alvo. A melhor maneira de garantir o sucesso é usar o tipo adequado de tubo para minimizar a perda de microesferas e ressuspender adequadamente as microesferas no tampão de eluição aquecido. O pré-aquecimento do tampão de eluição também pode ajudar significativamente. Para eluir a proteína, adicione 50 microlitros de tampão de eluição às microesferas.

As amostras que foram homogeneizadas e ligadas em tampão contendo cálcio são eluídas em tampão contendo EDTA e as amostras que continham tampão com EDTA são eluídas com cálcio. Incube as microesferas à temperatura ambiente durante 30 minutos em agitador. Misture as microesferas batendo suavemente no tubo a cada cinco minutos, aproximadamente.

Centrifugue as microesferas a 1500 RCF durante três minutos e remova cuidadosamente os 50 microlitros de SNAT para a amostra de proteína ligada por aspiração. Certifique-se de não perturbar as microesferas. Realize eletroforese em gel de SDS e western blot para identificar a proteína de interesse como um controle positivo na condição oposta.

Proproteína conhecida por ligar-se à calmodulina. Esta figura mostra um exemplo de ensaio de precipitação por calmodulina para testar a ligação da calmodulina à neurograndina com marcação GFP em comparação com a neurograndina endógena. A amostra de entrada homogênea mostra que a neurograndina GFP foi expressa além da neurograndina endógena e da quinase Ca²⁺/calmodulina-dependente tipo II, conforme esperado com base na ligação conhecida da neurograndina endógena.

Neuro Grandin marcado com GFP foi eluído na ausência de cálcio e não se ligou na presença de cálcio. Em contraste, a quinase dois dependente de calmodulina e controlada por cálcio foi eluída apenas na presença de cálcio e permaneceu não ligada em sua ausência. Isso demonstra que as microesferas de calmodulina estavam funcionando corretamente e que as EEU foram eficientes.

Acima de tudo, isso mostra que a neurogrina GFP se liga à apócalmodulina de maneira semelhante à forma endógena, sugerindo que a marcação com GFP não alterou a função da proteína recombinante. Uma vez dominada esta técnica, excluindo a eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e a análise por Western blot, o procedimento pode ser concluído em seis horas quando realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de rotular todas as amostras e tubos com a condição apropriada, pois qualquer alteração na concentração de cálcio pode comprometer todo o experimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar eficientemente a capacidade de proteínas específicas de se ligarem a um módulo CAL de maneira dependente de cálcio.

Ao coletar as proteínas de interesse, incubá-las com as nanopartículas de óxido de ferro preparadas adequadamente, eluir as proteínas ligadas e analisá-las por meio de análise sanguínea ocidental.