Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

Este sistema experimental tem como objetivo caracterizar a contribuição de proteínas específicas para o processo invasivo. Comece com a transdução retroviral de células com a proteína fluorescente de interesse. Também crie a matriz tridimensional de proteína Matrigel em inserts Transwell e prepare uma suspensão celular na diluição apropriada.

Utilizando o sistema de transwell com Matrigel, meça a resposta de transmigração ao quimioatraente com fármacos ou tratamentos experimentais e prossiga para visualizar e analisar a invasão celular por microscopia confocal. Em última análise, os resultados podem determinar a magnitude e o modo de invasão celular em uma matriz proteica tridimensional. A vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o ensaio tradicional de invasão em Transwell, é sua capacidade de fornecer dados tanto quantitativos quanto qualitativos sobre a invasão celular em uma matriz proteica tridimensional.

Minha colaboradora, Diane Creighton, demonstrará agora o método de cultura de células empacotadoras de retrovírus em DMEM contendo 10% de FBS por 48 horas. Transfete as células com DNA retroviral de acordo com as instruções do fabricante. Incube por 24 horas, lave os poços duas vezes com meio, adicione então 1,5 mililitro de DMEM com 10% de FBS por poço e incube por 48 horas para coletar o retrovírus empacotado.

Transfira o meio de cultura celular para tubos microcêntrifugos de dois mililitros, centrifugue para sedimentar quaisquer células e colete o sobrenadante em um tubo limpo. Armazene este estoque de retrovírus a menos 80 graus Celsius. Agora, para células retrotransduzidas, remova o meio de uma cultura de uma noite e adicione um mililitro do estoque de retrovírus suplementado com poli-green.

Após uma incubação de seis horas, adicione dois mililitros de D-M-E-M com 10% de S-B-F à placa e coloque as placas em um incubador a 37 graus Celsius. Durante a noite, reponha o meio e, após 24 horas, adicione o meio seletivo apropriado; quando as células estiverem confluentes, colete-as e realize a triagem por fluorescência utilizando células não transduzidas como referência. Colete as células com fluorescência superior à das células não transduzidas e congele alíquotas a menos 80 graus Celsius para uso futuro.

Este método depende da expressão de proteínas fluorescentes para visualização e permite obter informações sobre as contribuições individuais das células. Coloque o gel de matriz completo sobre gelo e, em seguida, dilua-o na proporção de um para um em PBS gelado. Agora, insira os transwell não revestidos em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.

Em seguida, pipete cuidadosamente 100 microlitros de gel de matri diluído nos poços e deixe solidificar a 37 graus Celsius. Enquanto isso, prepare as suspensões de células marcadas com fluorescência no meio de crescimento normal. Quando o gel de matri tiver solidificado, inverta os transbolsas e pipete 100 microlitros da suspensão celular na face inferior do filtro voltada para a saída.

Cubra cuidadosamente os transwell com a base de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços, fazendo contato com cada gota da suspensão celular. Incube a placa em posição invertida por quatro horas para permitir a adesão celular. Em seguida, vire as placas com a face para cima e lave cada transwell mergulhando-o duas vezes em um mililitro de meio livre de soro.

Em seguida, posicione o transwell em um terceiro poço contendo quaisquer medicamentos ou reagentes de tratamento. O agente pipeta suavemente 100 microlitros de meio contendo quimioatraente no transwell, sobre a mistura sólida de Matrigel e PBS. Incube por três a cinco dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para obter imagens de células não fluorescentes invadindo o Matrigel.

Coloque os transwell em placas de 24 poços frescas e pipete. Um mililitro de solução de cálcio AM quatro micromolar sobre cada tampão de matri gel, permitindo que transborde pelas laterais e marque pela parte superior e inferior. Incube por uma hora a 37 graus Celsius em atmosfera úmida com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, visualize por microscopia confocal.

Este primeiro método de coloração para visualização do estilo de vida permite a observação dos modos de invasão. Transfira cada transwell para uma placa de 24 poços nova, adicionando um mililitro de paraformaldeído 4% com 0,2% de Triton X-100, e incube em temperatura ambiente por meia hora. Após três lavagens com um mililitro de PBS, adicione RNase A durante 30 minutos, depois lave duas vezes com PBS para visualização a 0,01 miligrama por mililitro.

Iodeto de propídio diluído em PBS e deixe em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Lave três vezes com PBS. Nesta etapa, as câmaras de transmigração coradas com iodeto de propídio podem ser mantidas em temperatura ambiente no escuro por pelo menos um mês.

O segundo método de coloração celular exige fixação, mas permite uma quantificação mais rápida da invasão. Utilizando um microscópio confocal invertido, coloque o transwell com uma pequena quantidade de PBS residual sobre uma lamínula grande com uma objetiva de 20 vezes não imersiva e capture seções ópticas a cada 10 a 15 micrômetros a partir da base do tampão de Matrigel. Quantifique o grau de invasão utilizando fatias ópticas individuais. Além disso, construa objetos tridimensionais utilizando um software apropriado, como o Velocity, nesta série de fatias ópticas, em que as células foram coradas com amarelo de cálcio.

Como esperado, o número de células que invadem a partir do filtro diminui com a distância. Essa invasão pode ser quantificada. Reconstruções tridimensionais da invasão celular oferecem uma representação visual do modo de invasão.

Se as células forem marcadas pela expressão de proteínas fluorescentes, as posições de cada célula colorida poderão ser visualizadas em reconstruções tridimensionais, como mostrado nesta vista lateral. Além disso, cortes através da reconstrução podem oferecer insights sobre mecanismos moleculares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar este ensaio de invasão celular para obter mais informações sobre o processo evasivo do que aquelas obtidas com os métodos padrão.