Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

Este sistema experimental tem como objetivo caracterizar a contribuição de proteínas específicas para o processo invasivo. Comece com a transdução retroviral de células com a proteína fluorescente de interesse. Crie também a matriz 3D da proteína matrigel em inserções transwell e prepare uma suspensão celular na diluição apropriada.

Usando o sistema transwell Matrigel, meça a resposta de transmigração ao atrativo de quimioterapia com drogas de teste ou tratamentos e prossiga para visualizar e analisar a invasão celular por microscopia confocal. Em última análise, os resultados podem determinar a magnitude e o modo de invasão celular na matriz proteica tridimensional. O poder dessa técnica sobre os métodos existentes, como o tradicional ensaio de invasão de Transwell, é sua capacidade de conduzir dados quantitativos e qualitativos sobre a invasão celular em uma matriz de proteína tridimensional.

Minha colaboradora, Diane Creighton, agora demonstrará o método Cultura de células de empacotamento retroviral em DMEM contendo 10% de FBS por 48 horas. Transfectar as células com DNA retroviral de acordo com as instruções do fabricante. Incube por 24 horas, enxágue os poços duas vezes com meio, depois adicione 1,5 mililitros de 10% F-P-S-D-M-E-M por poço e incube por 48 horas para coletar o pacote Retrovírus.

Transfira o meio de cultura de tecidos para tubos de microcentrífuga de dois mililitros, centrifugue para remover as células e colha o supinato em um tubo limpo. Armazene este estoque de retrovírus a 80 graus Celsius negativos. Agora, para células retrotransduzidas, remova a mídia de uma cultura durante a noite e adicione um mililitro de estoque de retrovírus suplementado com poli verde.

Após uma incubação de seis horas, adicione dois mililitros de 10%F-B-S-D-M-E-M ao poço e coloque as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius. Durante a noite, reabasteça o meio e, após 24 horas, adicione o meio seletivo apropriado quando colher as células de forma confluente e classificar a fluorescência usando células não transduzidas como referência. Colete células com fluorescência maior do que as células não transduzidas e congele alíquotas a menos 80 graus Celsius para uso futuro.

Este método depende da expressão de proteínas fluorescentes para visualização e permite que os insights sobre as contribuições de células individuais sejam determinados. Thor complete o gel matri no gelo e depois dilua um a um em PBS gelado. Agora insira os transpoços não revestidos em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.

Em seguida, pipete cuidadosamente 100 microlitros de gel matri diluído nos poços e solidifique a 37 graus Celsius. Enquanto isso, prepare as suspensões celulares marcadas com fluorescência em seu meio de crescimento normal. Quando o gel matri estiver solidificado, inverta os transpoços e pipete 100 microlitros da suspensão celular na saída voltada para a parte inferior do filtro.

Cubra cuidadosamente os transwells com a base de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços fazendo contato com cada gota de suspensão celular. Incube a placa no estado invertido por quatro horas para permitir a fixação das células. Agora vire as placas com o lado direito para cima e lave cada transwell mergulhando em um mililitro de meio livre de soro duas vezes.

Em seguida, posicione o poço trans em um terceiro poço contendo quaisquer medicamentos ou reagentes de tratamento. Os agentes pipetam suavemente 100 microlitros de meio contendo atrativo de quimioterapia no transwell em cima da mistura de PBS de matrigel solidificada. Incube por três a cinco dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para obter imagens de células não fluorescentes invadindo Matrigel.

Coloque os transwells em pratos frescos de 24 poços e pipete. Um mililitro de solução AM de cálcio micromolar em cima de cada tampão de gel matri, permitindo que ele derrame pelos lados e manche por cima e por baixo Incube por uma hora a 37 graus Celsius em atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, imagem por microscopia confocal.

Este primeiro método de coloração de estilo de vida permite uma visualização dos modos de invasão. Transfira cada transwell para uma nova camada de placa de 24 poços, um mililitro de aldeído paraforme 4% 0,2% triton X 100 e incube em temperatura ambiente por meia hora. Depois de lavar três vezes com um mililitro, o PBS adiciona RNAs A por 30 minutos e, em seguida, lava duas vezes com PBS para visualização a 0,01 miligrama por mililitro.

Iodeto de propídio diluído em PBS e deixado em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Lave três vezes com PBS. Nesta fase, os transpoços de coloração de iodeto de propídio podem ser mantidos em temperatura ambiente no escuro por pelo menos um mês.

O segundo método de coloração celular requer fixação, mas permite uma quantificação mais rápida da invasão Usando um microscópio confocal invertido colocado transwell com uma pequena quantidade de PBS residual em uma grande lamínula sobre a objetiva de não imersão 20 vezes e captura seções ópticas a cada 10 a 15 mícrons da parte inferior do plugue matrigel. Quantifique a extensão da invasão usando fatias ópticas individuais. Também construir objetos tridimensionais usando software apropriado, como a velocidade nesta série de fatias ópticas, as células foram coradas com cálcio am.

Como esperado, o número de células que invadem o filtro diminui com a distância. Essa invasão pode ser quantificada. Reconstruções tridimensionais da invasão celular oferecem uma representação visual do modo de invasão.

Se as células são marcadas pela expressão de proteínas fluorescentes, as posições de cada célula colorida podem ser visualizadas em reconstruções tridimensionais, conforme mostrado nesta vista lateral. Além disso, cortes na reconstrução podem oferecer insights sobre mecanismos moleculares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar este ensaio de invasão celular para obter mais informações sobre o processo evasivo do que pode ser obtido com os métodos padrão.