Dimorfismo Sexo músculo esquelético de Proteomics

O objetivo geral deste procedimento é determinar a especificidade de gênero das diferenças nos perfis proteômicos do músculo esquelético. Isso é realizado primeiramente picando e homogeneizando completamente tecidos do bíceps braquial de camundongos machos e fêmeas, a fim de extrair a maioria das proteínas. Em seguida, a amostra é aplicada em uma tira de gel IEF, e as proteínas são separadas com base em seu ponto isoelétrico, seguido por uma eletroforese SDS-PAGE, que realiza a separação na segunda dimensão de acordo com o tamanho. Após a coloração e a obtenção das imagens dos géis, os perfis proteômicos das amostras musculares de machos e fêmeas são comparados, e as manchas com diferenças significativas na abundância entre os dois gêneros são recortadas.

Por fim, as proteínas nos tampões de gel são digeridas com tripsina. Os peptídeos resultantes são extraídos do gel e submetidos à cromatografia líquida em nanoescala e à análise por espectrometria de massas para identificação. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram a expressão diferencial de proteínas em duas ou mais condições experimentais por meio da eletroforese em gel bidimensional e da proteômica baseada em espectrometria de massas.

Embora este método possa fornecer informações sobre a especificidade muscular relacionada ao gênero, ele também pode ser aplicado a outras células, tecidos, órgãos ou fluidos em diferentes estados fisiológicos. O procedimento será demonstrado pela Dra. Kalina Diva, diretora técnica do Centro de Proteômica do Smith College. Após isolar, limpar e picar o músculo esquelético de camundongo com 45 microlitros de tampão de extração por grama de tecido, consulte o protocolo escrito para esta e todas as demais fórmulas de tampão; utilizando um pistilo motorizado, homogeneíze o tecido sete vezes, durante 15 segundos cada, a quatro graus Celsius, com resfriamento de dois minutos em gelo entre cada homogeneização.

Centrifugue as amostras a 15.800 Gs durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Guarde o sobrenadante e meça seu volume. Descarte o pellet para precipitar as proteínas em três volumes de gelo.

Acetona grau reagente fria por volume de sobrenadante. Vortexar os tubos por 15 segundos, em seguida centrifugar a 15.800 Gs por 10 segundos para formar os pellets. Descartar o sobrenadante e ressuspender os pellets no tampão de extração com o pistilo motorizado e hastes de agitação de polipropileno; precipitar as proteínas uma segunda vez adicionando três volumes adicionais de acetona.

Após ressuspender o pellet no tampão de extração, determine a concentração proteica e/ou armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Para realizar a focalização isoelétrica das proteínas, retire uma tira pronta IPG do congelador a menos 20 graus Celsius e deixe-a equilibrar à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Vortexe a amostra e pipete de 600 a 800 microgramas de proteína em uma linha reta na borda traseira de um canal na bandeja de reidratação da amostra, deixando cerca de um centímetro em cada extremidade.

Usando pinças, remova a cobertura plástica da tira IPG, certificando-se de manipular apenas as extremidades da tira e evitando qualquer contato com o gel. Observe a extremidade marcada como positiva da tira e posicione-a no lado esquerdo da bandeja. Coloque a tira IPG com o lado do gel voltado para baixo sobre a amostra.

Evite aprisionar bolhas por baixo. Deixe hidratar por uma hora. Cubra a tira com 2,5 mililitros de óleo mineral.

Cubra a bandeja com uma tampa e deixe-a reidratar durante a noite. No dia seguinte, à temperatura ambiente, coloque uma mecha de papel em ambas as extremidades do canal de focagem e umedeça cada uma com 10 microlitros de água millipore. Remova a fita IPG e segure-a verticalmente por cerca de 10 segundos.

Para drenar o óleo, absorva o suporte plástico com um lenço Kim. Coloque a tira IPG com o lado do gel voltado para baixo, com a extremidade básica voltada para a esquerda. Na bandeja de focalização, cubra a tira com 2,5 mililitros de óleo mineral.

Posicione a bandeja na célula protean IEF e programe um protocolo de três etapas a uma temperatura padrão da célula de 20 graus Celsius, uma corrente máxima de 50 microampères por tira e sem tempo de reidratação. Após a conclusão do programa, transfira a tira de gel com a face voltada para cima para uma bandeja de equilibração de 11 centímetros. Adicione quatro mililitros de tampão redutor ao canal e equilibre a tira por 10 minutos com agitação suave.

Remova o tampão de redução e adicione quatro mililitros de tampão de alquilação ao canal, equilibrando a tira com agitação por mais 10 minutos. Enxágue a tira IPG mergulhando-a brevemente em tampão de eletroforese XSDS 1X. Em seguida, posicione a tira com a face do gel voltada para cima sobre a placa traseira de um critério de 11 centímetros.

Gel pré-fabricado de poliacrilamida tris-HCl-SDS de 10,5 a 14% e empurre-o suavemente para garantir contato completo com o gel SDS. Certifique-se de que não haja bolhas presas entre as duas superfícies dos géis. Cubra a tira IPG com um mililitro de solução fundida de agro e deixe solidificar por cinco minutos.

Em seguida, carregue cinco microlitros do marcador proteico no poço único. Execute o gel em tampão SDS a 200 volts à temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius. Quando a frente do corante atingir a base do gel, remova-o do molde plástico e cora-o durante a noite agitando suavemente em azul brilhante de Kumasi.

Agite o gel na solução de fixação duas vezes, durante três horas cada, e deixe em repouso durante a noite em fixador. Armazene o gel em ácido acético 7% para análise. Após a obtenção da imagem do gel, realize uma análise comparativa dos padrões de manchas entre os géis e recorte as manchas de interesse, adicionando 200 microlitros de solução de fixação aos tampões de gel. Vortexie e incube as amostras à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação.

Em seguida, remova e descarte cuidadosamente a solução e repita o procedimento. Adicione 30 microlitros de tampão redutor recém-preparado aos tubos contendo os tampões de gel e incube a 60 graus Celsius por 10 minutos. Deixe as amostras esfriarem.

Em seguida, remova e descarte o tampão. Adicione 30 microlitros de tampão de alquilação e incube as amostras no escuro, à temperatura ambiente, por uma hora. Remova e descarte o tampão de alquilação. Lave as géis em tampão adicionando 200 microlitros de solução de dessulfurização a cada tubo e incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Remova e descarte a solução de contenção e repita a lavagem. Em seguida, adicione 50 microlitros de acetonitrila aos tampões de gel e incube-os por 10 minutos à temperatura ambiente para permitir que sequem e contraiam. Depois, remova cuidadosamente a acetonitrila e repita com os pedaços de gel.

Deve apresentar aparência branca e pequena. Deixe as fatias do gel secarem em um concentrador por 10 minutos. Inche as fatias do gel adicionando 10 microlitros de solução de tripsina ativada.

Incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione 25 microlitros de tampão de digestão aos tubos. Incube as amostras à temperatura ambiente durante a noite com agitação, sonique as amostras por 10 minutos e centrifugue antes de transferir o sobrenadante para um tubo novo.

Para extrair mais peptídeos, adicione 10 microlitros de ácido fórmico 0,1% aos tampões e incube por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação; sonique as amostras por 10 minutos. Recolha o sobrenadante e combine-o com o sobrenadante previamente armazenado. As proteínas podem então ser dessalinizadas e preparadas para espectrometria de massas acoplada à CLAE. Músculo esquelético de machos e fêmeas não exercitados foi extraído e separado em um mapa bidimensional.

O primeiro nível do proteoma comparativo muscular, uma vez visualizado por meio de imagem digital de alta resolução, revelou cerca de 800 pontos proteicos em cada amostra, conforme mostrado aqui. Utilizando o mapa do proteoma masculino como referência, é evidente que existem inúmeros pontos cuja abundância varia no proteoma feminino: pontos que aumentaram em duas vezes ou mais nas fêmeas estão circulados em vermelho, e aqueles que diminuíram em duas vezes ou mais estão circulados em azul. As identidades dos pontos proteicos que variam mais de duas vezes para cima ou para baixo e que são estatisticamente significativos, com N igual a cinco camundongos, são determinadas por análise da sequência de aminoácidos utilizando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas.

Neste gráfico, o eixo x representa camundongos fêmeas antes do exercício, e o eixo Y representa um grupo em ponto temporal de zero hora após um único episódio de exercício. Os resultados mostram que as fêmeas demonstram uma acentuada diminuição no metabolismo energético de açúcares, nas enzimas e nas isoformas da enzima creatina quinase, um sistema diferente de fornecimento de energia nos músculos. Tanto humanos quanto animais exibem níveis séricos mais elevados de CK em repouso e após o exercício, mas os níveis séricos de CK não necessariamente se correlacionam com a quantidade de miofibrilas.

Esse dimorfismo de gênero na abundância celular da CK no músculo bíceps braquial de miren é uma descoberta inédita e pode explicar os níveis fisiologicamente diferentes de CK sérica. Após este procedimento, outros métodos, como o blot imunológico quantitativo, podem ser realizados para verificar os resultados. Após assistir a este vídeo, deveremos ter uma boa compreensão de como preparar e separar amostras para perfis diferenciais de proteoma.