Name: Dimorfismo Sexo músculo esquelético de Proteomics (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a analisar proteínas do músculo esquelético usando eletroforese bidimensional e espectrometria de massa. Este método identifica diferenças de expressão proteica entre sexos em amostras de tecido muscular.

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Agradecemos a Yutian Gan para o uso da Figura 3. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation 0420971; do Smith College Blakeslee, Wilens e fundos de Holmes, e da Howard Hughes Medical Institute.

1. Preparação de amostras <ol><li> Use tecido fresco, congelado ou flash-RNAlater tratados de camundongos como matéria-prima. Blot fora qualquer excesso com um conservante Kimwipe antes de prosseguir. </li><li> Remova todos os tendões e fáscia muscular e em todo o mince o tecido com um único lâminas de barbear afiada por 2 min em placas de vidro refrigerada em uma câmara fria (4 ° C) até que o tecido é bem picada ou em pó. Recolher a amostra para um tubo de microcentrífuga pré-pesados ​​e determinar o peso do tecido. Não use mais de 10 mg do tecido como o seu material de partida. </li><li> Adicionar 45 mL tampão de extração (8 M uréia, 50 mM DTT, CHAPS 4%, 0,2% ampholytes transportadora 08/05, 0,0002% de azul de bromofenol) por um tecido mg picada, à temperatura ambiente. Se o volume for superior a 350 mL, adicione 350 mL inicialmente e homogeneizar (passo 1.4), em seguida, adicione o restante do buffer para minimizar respingos. </li><li> Homogeneizar o tecido sete vezes com um pilão motorizado (Kontes Corp) por 15 segundos a4 ° C, com dois minutos de resfriamento sobre o gelo entre cada homogeneização. </li><li> Centrifugar as amostras a 15.600 xg por 30 minutos a 4 ° C. Salve o sobrenadante e medir o seu volume. A célula de detritos pellet é descartado. </li><li> Precipitar as proteínas no sobrenadante com acetona gelada grau reagente (3 vezes v: relação v). Vortex por 15 segundos. Centrífuga para 15.600 xg por 10 segundos para formar pelotas, e ressuspender em tampão de extração com o motor Kontes e hastes de polipropileno mexendo (BioSpec Prod) </li><li> Repita o passo 1,6. </li><li> Quer continuar com a estimativa de concentração de proteínas das amostras ou armazená-los a -20 ° C. </li></ol> 2. Estimativa de concentração de proteína Use o ensaio Lowry 7 ou 8 do ensaio BCA (Pierce); apontar para cerca de 4,5 mg ml -1. 3. Focalização isoelétrica <ol><li> Retire uma tira IPG ReadyStrip (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)de -20 ° C e deixe-se equilibrem em temperatura ambiente por 10-15 min. </li><li> Vortex da amostra e pipeta 600-800 g (volume total 200 mL) de amostra de proteína em uma linha reta na extremidade traseira de um canal na bandeja de reidratação de amostra, deixando cerca de 1 cm em cada extremidade. </li><li> Usando pinça, retire a tampa de plástico da tira IPG - certifique-se de lidar com apenas as extremidades da tira e evitar qualquer contato com o gel. Nota final básicos da tira e posicione-o no lado esquerdo da bandeja. Coloque a tira de IPG gel lado-down no topo da amostra, evitar bolhas prendendo embaixo. Permita que ele se hidratar durante uma hora. </li><li> Sobreposição com 2,5 mL de óleo mineral (BioRad). Cubra o tabuleiro com a tampa, e deixe hidratar durante a noite a temperatura ambiente. </li><li> Coloque um pavio de papel em ambas as extremidades do canal bandeja de foco e molhados cada um com 10 mL de água Millipore. </li><li> Retire IPG strip e mantenha verticalmente por cerca de 10 segundos a drenar o óleo. Blot a b plásticoacking com um Kimwipe. </li><li> Coloque o lado gel IPG strip para baixo e com final básicos para a esquerda na bandeja de foco. Cobrir a faixa com 2,5 mL de óleo mineral. </li><li> Coloque a bandeja para dentro da célula IEF PROTEAN (Bio-Rad) e um programa de um protocolo de 3 etapas (Tabela 1) à temperatura de célula padrão de 20 ° C, uma corrente máxima de 50 mA / strip, e não há tempo de reidratação. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tensão </td><td> Tempo </td><td> Volt-Hrs </td><td> Rampa </td></tr><tr><td> Passo 1 </td><td> 250 </td><td> 20 min </td><td></td><td> Linear </td></tr><tr><td> Passo 2 </td><td> 8000 </td><td> 2,5 hr </td><td></td><td> Linear </td></tr><tr><td> Passo 3 </td><td> 8000 </td><td></td><td> 40000 </td><td> Rápido </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td> 6,5 hr </td><td> 40000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Três etapas protocolo de PROTEAN célula IEF de 11 centímetros IPG tiras. </li><li> Pegue as tiras IPG para fora da célula IEF usando uma pinça. Blot o apoio de plástico com uma Kimwipe e coloque o lado gel IPG strip-se em uma bandeja de reidratação limpo. Você pode cobrir a bandeja de reidratação e envolvê-la com filme plástico e guarde a - 80 ° C ou prosseguir. </li></ol> 4. SDS eletroforese em gel de poliacrilamida <ol><li> Transferência da faixa (até lado gel) em uma bandeja de equilíbrio 11 cm. </li><li> Adicionar 4 mL de tampão de redução (6 M uréia, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, glicerol 20%, DTT 2%) para o canal e equilibrar a tira durante 10 min com agitação suave. </li><li> Remova o tampão de redução, adicionar 4 mL de tampão de alquilação (6 M uréia, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, glicerol 20%, 2,5% iodoacetamida) e equilibrar a tira durante 10 minutos com agitação suave. </li><li> Lave a tira IPG por imersão a strip brevemente em um tampão SDS X rodando (25 mM Tris, 192 mM de glicina, 0,1% SDS, pH 8.2). </li><li> Lay o lado gel strip para cima da placa traseira do Critério de 11 cm pré-moldados de 10,5% -14% Tris-HCl em gel de poliacrilamida SDS (Bio-Rad) e empurre-o suavemente de modo que ele faz pleno contato com o gel SDS; certifique-se não haja bolhas entre as duas superfícies gel. </li><li> Sobreposição da tira IPG com 1 mL de solução de agarose derretida (0,5% agarose, 25 mM Tris, 192 mM de glicina, 0,1% SDS, de azul de bromofenol) e deixe o agarose solidificar por 5 minutos. </li><li> Carga de 5 mL de proteína marcadora 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) no único poço como padrões de peso molecular. </li><li> Execute o gel em tampão SDS (25 mM Tris, 192 mM de glicina, 0,1% SDS, pH 8,2) em 200 V à temperatura ambiente ou em uma câmara fria (4 ° C) usando a migração frente corante azul de bromofenol para monitorar a eletroforese. </li><li> Remova o gel do elenco de plástico e mancha durante a noite, agitando suavemente em Coomassie Brilliant BlueR-250 mancha (45,5% de metanol, 45,5% dH2O, 9,0% de ácido acético, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). </li><li> Agitar o gel em uma solução Destain (45,5% de metanol, 45,5% dH 2 O, 9,0% de ácido acético) duas vezes por 3 horas cada um e em Destain 2 (metanol 5%, 90% dH 2 O, 5% de ácido acético) durante a noite. Armazenar o gel em 7% de ácido acético para análise. </li></ol> 5. Gel de imagem e análise <ol><li> Capturar imagens dos géis usando o programa de software One Quantidade que opera o sistema de imagem VersaDoc (BioRad). Cortar as áreas da imagem de modo uniforme para todos os géis em sua experiência. </li><li> Carregar as imagens recortadas no programa PDQuest software 8.0 para criar um conjunto de experimento. Siga o assistente de configuração da experiência para definir os parâmetros para detecção de ponto e ponto de correspondência através do gel. Inspecionar e refinar o local correspondência resultados manualmente, se necessário. </li><li> Realizar uma análise quantitativa e estatística dos géis para detectar manchas de proteínas combinado com two-fold ou superior diferenças estatisticamente significativas na expressão entre os dois grupos gel. Crie uma análise conjunto com estes pontos de interesse e cortá-los, utilizando um cortador local EXQuest (BioRad) para tripsina digestão e LC-MS identificação baseada em proteína. </li></ol> 6. Em gel-digestão tríptica Para esta etapa um Pierce modificado In-Gel Digest tríptico Kit (# 89871X, Pierce) protocolo é usado. <ol><li> Adicionar 200 mL de solução de descoloração (25 mM de bicarbonato de amônio, acetonitrila 50%) para as velas em gel. Vortex e incubar as amostras a 37 ° C por 30 minutos com agitação. Remova e elimine cuidadosamente a solução. </li><li> Repita o passo 6.1. </li><li> Adicionar 30 mL de recém-preparados buffer (50 mM Tris [2-carboxietil] fosfina, 22,5 mM de bicarbonato de amônio) para os tubos contendo as velas em gel e incubar a 60 ° C por 10 minutos. Reduzindo </li><li> Permitem que as amostras para esfriar e, depois, remover e descartar o buffer de redução.</li><li> Adicionar 30 mL de tampão de alquilação (100 iodoacetamida mM, 20 mM de bicarbonato de amônio, preparado imediatamente antes da utilização em papel alumínio envolto em tubos. Incubar as amostras no escuro à temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> Remova e descarte o buffer de alquilação. Lave as velas gel pela adição de 200 mL de solução de descoloração a cada tubo. Incubar as amostras a 37 ° C por 15 minutos. </li><li> Remova e descarte a solução de descoloração e repita a lavagem. </li><li> Adicionar 50 mL de acetonitrila para as velas em gel e incube-os por 10 minutos à temperatura ambiente, que lhes permitam reduzir seca, em seguida, remova cuidadosamente a acetonitrila. </li><li> Repita 6,8 passo mais uma vez. Pedaços de gel devem ser brancos e pequenos. </li><li> Permitem que pedaços de gel para secar em um concentrador de CentriVap (Labconco, modelo EX1245) por 10 minutos. </li><li> Engrossar as peças gel, adicionando 10 mL de solução de tripsina ativado (10 tripsina ng / mL, bicarbonato de amônio 25 mM). Incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. </li><li> Adicionar 25 mL tampão de digestão (25 mM de bicarbonato de amônio) para os tubos. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante a noite com agitação. </li><li> Sonicate as amostras por 10 minutos (Branson, modelo banho sonicador 2510) e spin-las antes de remover o sobrenadante para um novo tubo. Salve o sobrenadante. </li><li> Para continuar a extrair os peptídeos, adicionar 10 mL de 0,1% de ácido fórmico e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente com agitação. Sonicate as amostras por 10 minutos, recolher o sobrenadante e combinam com sobrenadante salvou na etapa 6.13. </li></ol> 7. Dessalinização microescala de extratos de peptídeo <ol><li> Remover bicarbonato de amônio e outros sais nos extratos peptídeo com a ajuda de PepClean C-18 Colunas Spin (ThermoFisher) de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Peptídeos eluir duas vezes com 20 mL de acetonitrila 70%, evaporar as amostras secas por centrifugação no Concentrador CentriVap por 1 hora e ressuspenderos peptídeos em 10 mL de ácido fórmico 0,1% para análise de MS. </li></ol> 8. Identificação de proteínas por espectrometria de massa HPLC-coupled <ol><li> 5 mL separado da mistura de peptídeos em um cromatógrafo líquido de alta performance (HPLC) mais de 40 minutos, utilizando um gradiente linear de acetonitrila 20-50% com 0,2% de ácido fórmico em um Pepswift coluna PS-DVB monolítica (Dionex) acoplado a um nanospray I de origem para um espectrômetro de massa ion trap (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) a uma vazão de 400 nL / min na ponta. </li><li> Detectar peptídeo MS1 sinais entre 400-1400 m / z e permitir a três picos de íon mais intenso a ser isolado para MS2 seqüenciamento por CID com a exclusão dinâmica. </li><li> Para identificação de proteínas, analisar os resultados através de um peptídeo Sequest pesquisa de banco de dados do mouse de referência (BioWorks software, Thermo-Fisher Scientific) com uma modificação cisteína estática alquilados e modificações dinâmicas para fosforilação (serina, treonina, tirosina), methylamento (histidina), oxidação (metionina), ADP ribosylation (arginina), e N-terminal acetilação. Aplicar critérios conservadores de correspondência (por exemplo, a tolerância peptídeo definido para 2 AMU e 1,00 tolerância fragmento, proteínas contêm pelo menos 2 peptídeos passar um Xcorr Carga vs Estado de filtro [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2,00, z = 3 / x = 2,50, z = 4 / x = 3,00] e uma probabilidade de p &lt;0,05) 5 manualmente e inspecionar os espectros de MS para a identificação de proteínas confiante. </li></ol> 9. Resultados representativos: Masculino e feminino não exercidas, músculo esquelético murino (bíceps braquial) foi extraído e separado em um mapa bidimensional 5, o primeiro nível do músculo comparativa proteoma (Figura 2). Uma vez visualizada usando alta resolução de imagem digital; cerca de 800 spots de proteínas foram detectadas em cada um. Usando o mapa do sexo masculino proteoma como linha de base, é claro que existem inúmeros pontos que a mudança em abundância no proteoma do sexo feminino. As intensidades de ponto são medidas da mudança nos valores de proteína (Figura 3). As identidades dos spots de proteínas que mudam mais de duas vezes (para cima ou para baixo) e são estatisticamente significativos (p &lt;0,05) com um n = 5 camundongos, são determinados por análise de seqüência de aminoácidos por espectrometria de massa de cromatografia líquida acoplada. Estes resultados mostram que as mulheres demonstram um decréscimo abundância em enzimas de açúcar metabolismo energético e na enzima creatina quinase (CK) isoformas, um sistema de fornecimento de energia em diferentes músculos. Seres humanos e animais mostram maior sexo masculino níveis séricos de CK em repouso e exercício seguinte 9,10, mas os níveis séricos de CK não necessariamente correlacionado com a quantidade de perturbação miofibrilar 11,12. Este dimorfismo de gênero na abundância celular da CK no músculo bíceps braquial murino é uma novela finding5 e pode responder à fisiologicamente diferentes níveis séricos de CK. Números: g1.jpg "/&gt; Figura 1. Um esquema geral do protocolo para a proteômica comparativa. O protocolo está subdividido em três grupos: preparação de amostras, análise de amostra e, identificação de proteínas. As extremidades de cada um destes três grupos de protocolos também são razoáveis ​​lugares pausa, embora os melhores resultados são garnered se o protocolo geral é realizada sem parar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Comparação de proteína murina bíceps braquial feminino pontos em relação aos pontos idênticos em bíceps braquial do sexo masculino (verde círculos o). Spots de que o aumento maior ou igual a duas vezes nas fêmeas estão circulados vermelho (o) e aqueles que diminuíram menos do que ou igual a duas vezes estão circulados azul (o). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Análise Gel Intensity Spot:. Eixo X, do sexo femininopré-exercício (controle, n = 5); eixo Y, única fêmea luta 0 grupo de pontos de tempo h (n = 5). Linha de regressão: coeficiente de correlação = 0,919; inclinação = 0,976; interceptar = -0,0293. Pontos acima da linha vermelha e abaixo da linha azul mudar mais de + / - duas vezes.

<ol><li>Fehrenbach, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFehrenbach%2C+E+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22">Molecular and Cellular Exercise Physiology</a>. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A LC / MS proteômica método aqui apresentado é um protocolo mais confiável e reprodutível para uma rápida análise do primeiro nível do proteoma do músculo esquelético. Que permite uma comparação razoavelmente expediente da especificidade de gênero. Proteínas baixa abundância exigiria um fracionamento da amostra do músculo para eliminar o maior número de proteínas contráteis quanto possível, aumentando assim as proteínas pouco abundantes. Adaptando o perfil proteoma pode ser realizado com diferentes pH tiras gama IPG e géis de gradiente alternativo percentual, se desejar. Mais sensíveis manchas fluorescentes existe, mas é recomendável que cada laboratório determine a linearidade destas manchas em seu sistema. Para uma análise mais rigorosa de expressão da proteína do sistema DIGE (bidimensional In-Gel sistema de eletroforese, a GE Healthcare Life Sciences) pode ser usado, no entanto, este não adiciona um nível de complexidade da metodologia. Além disso, o protocolo aqui descrito pode ser usado com a maioria dos animal tecidos para os quais um genoma foi seqüenciado, bem como de seqüenciamento de novo de uma proteína a partir de qualquer fonte, desde que ele pode ser resolvido em um gel de duas dimensões, uma vez que se sobrepõem fragmentos enzimática pode ser gerado usando enzimas de elevada pureza, além à tripsina. Amostras a partir de fontes de outros tecidos pode exigir algumas alterações na metodologia de extração, especialmente se procurar proteínas da membrana e hidrofóbicas, no entanto, temos tido bons resultados usando este protocolo com cardíacas, fígado, rim e tecidos cerebrais. Outras modificações pós-traducionais podem ser detectados através da modificação do espectro de massa critérios de pesquisa do banco de dados. Em suma, temos apresentado um protocolo razoavelmente detalhadas inicial para análises de proteoma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Tipo </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> PepClean C-18 Giro Colunas </td><td> Consumível </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> PI-89870 </td><td></td></tr><tr><td> Pepswift monolítica coluna (100um x 5 cm) </td><td> Consumível </td><td> Dionex </td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td> Critério de pré-moldados 10,5% -14% Tris-HCl SDS géis de poliacrilamida </td><td> Consumível </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> Readystrip tiras IPG </td><td> Consumível </td><td> BioRad </td><td> PH variando faixas </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> A465-1 </td><td></td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Reagente </td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagente </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> Overlay solução </td></tr><tr><td> Bicarbonato de amônio </td><td> Reagente </td><td> Fluka </td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Lyte Ampholytes </td><td> Reagente </td><td> BioRad </td><td></td><td> PH variando faixas </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie blue R-250 </td><td> Reagente </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (TDT) </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Reagente </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Iodoacetamida </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Reagente </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sódio </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base de </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [2-carboexyethyl] fosfina </td><td> Reagente </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina Endoproteinase, TPCK tratado, grau MS </td><td> Reagente </td><td> Perfurar </td><td> 90055 </td><td> modificado </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td> Água </td><td> Reagente </td><td> Burdick &amp; Jackson </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> Concentrador CentriVap </td><td> Tool </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest cortador local </td><td> Ferramenta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP Max ion espectrômetro de massa armadilha </td><td> Ferramenta </td><td> ThermoFisher Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Motorizada pilão </td><td> Ferramenta </td><td> Kontes Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polipropileno mexendo </td><td> Ferramenta </td><td> BioSpec Prod </td><td></td><td></td></tr><tr><td> varas </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN célula IEF </td><td> Ferramenta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sonicador </td><td> Ferramenta </td><td> Branson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Além disso Surveyor HPLC sistema </td><td> Ferramenta </td><td> ThermoFisher Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc imagem sistema </td><td> Ferramenta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dimorfismo sexo músculo esquelético de proteomics

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Contração bruta no músculo esquelético é determinado principalmente por um número relativamente pequeno de proteínas contráteis, no entanto, este tecido é também extremamente adaptáveis ​​a fatores ambientais, tais como uma hipertrofia por meio de exercícios de resistência e atrofia por desuso. É, assim, apresenta remodelação e adaptação ao stress (calor, isquemia, metais pesados, etc.) 2,3. Podem ocorrer danos ao músculo por uma força muscular exercendo ao mesmo tempo o alongamento, o chamado 4 contração excêntrica. As proteínas contráteis pode ser prejudicada em tais esforços e precisa ser reparado, degradadas e / ou ressintetizamos; estas funções não fazem parte das proteínas contráteis, mas de outras proteínas muito menos abundante na célula. Para determinar qual subconjunto de proteínas está envolvida na melhoria deste tipo de dano, um proteoma global deve ser estabelecida antes do exercício 5 e seguido, após o exercício para determinar o diferencialexpressão da proteína e, assim, destacar proteínas candidato nas adaptações ao dano e sua reparação. Além disso, a maioria dos estudos do músculo esquelético têm sido realizados sobre o macho da espécie e, portanto, pode não ser representativa do músculo feminino. Neste artigo apresentamos um método para extrair proteínas reproduzível dos músculos masculinos e femininos, e separando-os por eletroforese bidimensional em gel seguido de alta resolução de imagem digital 6. Isto fornece um protocolo para spots (e proteínas posteriormente identificado) que mostram uma diferença estatisticamente significativa (p &lt;0,05), duas vezes aumentar ou diminuir, aparecer ou desaparecer a partir do estado do controle. Estes são, então, excisadas, digeridos com tripsina e separados por alta pressão cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa (LC / MS) para identificação de proteínas (LC / MS / MS) 5. Esta metodologia (Figura 1) pode ser usado em muitos tecidos com pouca ou nenhuma modificação (fígado, cérebro, ouvirt etc.).

Um conjunto simples e direta de métodos para isolar e determinar a identidade das proteínas mais abundantes expressa no músculo esquelético. Cerca de 800 spots são discernidos em um gel de duas dimensões de 10 mg do músculo, o que permite a determinação de gênero específico expressão da proteína. Esses métodos produzem resultados equivalentes na maioria dos tecidos.

Dimorfismo Sexo músculo esquelético de Proteomics

A contração bruta no músculo esquelético é determinada primariamente por um número relativamente pequeno de proteínas contráteis; no entanto, este tecido também é notavelmente...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a especificidade de gênero das diferenças nos perfis proteômicos do músculo esquelético. Isso é realizado primeiramente picando e homogeneizando completamente tecidos do bíceps braquial de camundongos machos e fêmeas, a fim de extrair a maioria das proteínas. Em seguida, a amostra é aplicada em uma tira de gel IEF, e as proteínas são separadas com base em seu ponto isoelétrico, seguido por uma eletroforese SDS-PAGE, que realiza a separação na segunda dimensão de acordo com o tamanho. Após a coloração e a obtenção das imagens dos géis, os perfis proteômicos das amostras musculares de machos e fêmeas são comparados, e as manchas com diferenças significativas na abundância entre os dois gêneros são recortadas.Por fim, as proteínas nos tampões de gel são digeridas com tripsina. Os peptídeos resultantes são extraídos do gel e submetidos à cromatografia líquida em nanoescala e à análise por espectrometria de massas para identificação. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram a expressão diferencial de proteínas em duas ou mais condições experimentais por meio da eletroforese em gel bidimensional e da proteômica baseada em espectrometria de massas.Embora este método possa fornecer informações sobre a especificidade muscular relacionada ao gênero, ele também pode ser aplicado a outras células, tecidos, órgãos ou fluidos em diferentes estados fisiológicos. O procedimento será demonstrado pela Dra. Kalina Diva, diretora técnica do Centro de Proteômica do Smith College. Após isolar, limpar e picar o músculo esquelético de camundongo com 45 microlitros de tampão de extração por grama de tecido, consulte o protocolo escrito para esta e todas as demais fórmulas de tampão; utilizando um pistilo motorizado, homogeneíze o tecido sete vezes, durante 15 segundos cada, a quatro graus Celsius, com resfriamento de dois minutos em gelo entre cada homogeneização.Centrifugue as amostras a 15.800 Gs durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Guarde o sobrenadante e meça seu volume. Descarte o pellet para precipitar as proteínas em três volumes de gelo.Acetona grau reagente fria por volume de sobrenadante. Vortexar os tubos por 15 segundos, em seguida centrifugar a 15.800 Gs por 10 segundos para formar os pellets. Descartar o sobrenadante e ressuspender os pellets no tampão de extração com o pistilo motorizado e hastes de agitação de polipropileno; precipitar as proteínas uma segunda vez adicionando três volumes adicionais de acetona.Após ressuspender o pellet no tampão de extração, determine a concentração proteica e/ou armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Para realizar a focalização isoelétrica das proteínas, retire uma tira pronta IPG do congelador a menos 20 graus Celsius e deixe-a equilibrar à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Vortexe a amostra e pipete de 600 a 800 microgramas de proteína em uma linha reta na borda traseira de um canal na bandeja de reidratação da amostra, deixando cerca de um centímetro em cada extremidade.Usando pin&ccedil;as, remova a cobertura pl&aacute;stica da tira IPG, certificando-se de manipular apenas as extremidades da tira e evitando qualquer contato com o gel. Observe a extremidade marcada como positiva da tira e posicione-a no lado esquerdo da bandeja. Coloque a tira IPG com o lado do gel voltado para baixo sobre a amostra.Evite aprisionar bolhas por baixo. Deixe hidratar por uma hora. Cubra a tira com 2,5 mililitros de óleo mineral.Cubra a bandeja com uma tampa e deixe-a reidratar durante a noite. No dia seguinte, à temperatura ambiente, coloque uma mecha de papel em ambas as extremidades do canal de focagem e umedeça cada uma com 10 microlitros de água millipore. Remova a fita IPG e segure-a verticalmente por cerca de 10 segundos.Para drenar o óleo, absorva o suporte plástico com um lenço Kim. Coloque a tira IPG com o lado do gel voltado para baixo, com a extremidade básica voltada para a esquerda. Na bandeja de focalização, cubra a tira com 2,5 mililitros de óleo mineral.Posicione a bandeja na célula protean IEF e programe um protocolo de três etapas a uma temperatura padrão da célula de 20 graus Celsius, uma corrente máxima de 50 microampères por tira e sem tempo de reidratação. Após a conclusão do programa, transfira a tira de gel com a face voltada para cima para uma bandeja de equilibração de 11 centímetros. Adicione quatro mililitros de tampão redutor ao canal e equilibre a tira por 10 minutos com agitação suave.Remova o tampão de redução e adicione quatro mililitros de tampão de alquilação ao canal, equilibrando a tira com agitação por mais 10 minutos. Enxágue a tira IPG mergulhando-a brevemente em tampão de eletroforese XSDS 1X. Em seguida, posicione a tira com a face do gel voltada para cima sobre a placa traseira de um critério de 11 centímetros.Gel pré-fabricado de poliacrilamida tris-HCl-SDS de 10,5 a 14% e empurre-o suavemente para garantir contato completo com o gel SDS. Certifique-se de que não haja bolhas presas entre as duas superfícies dos géis. Cubra a tira IPG com um mililitro de solução fundida de agro e deixe solidificar por cinco minutos.Em seguida, carregue cinco microlitros do marcador proteico no poço único. Execute o gel em tampão SDS a 200 volts à temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius. Quando a frente do corante atingir a base do gel, remova-o do molde plástico e cora-o durante a noite agitando suavemente em azul brilhante de Kumasi.Agite o gel na solução de fixação duas vezes, durante três horas cada, e deixe em repouso durante a noite em fixador. Armazene o gel em ácido acético 7% para análise. Após a obtenção da imagem do gel, realize uma análise comparativa dos padrões de manchas entre os géis e recorte as manchas de interesse, adicionando 200 microlitros de solução de fixação aos tampões de gel. Vortexie e incube as amostras à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação.Em seguida, remova e descarte cuidadosamente a solução e repita o procedimento. Adicione 30 microlitros de tampão redutor recém-preparado aos tubos contendo os tampões de gel e incube a 60 graus Celsius por 10 minutos. Deixe as amostras esfriarem.Em seguida, remova e descarte o tampão. Adicione 30 microlitros de tampão de alquilação e incube as amostras no escuro, à temperatura ambiente, por uma hora. Remova e descarte o tampão de alquilação. Lave as géis em tampão adicionando 200 microlitros de solução de dessulfurização a cada tubo e incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos.Remova e descarte a solução de contenção e repita a lavagem. Em seguida, adicione 50 microlitros de acetonitrila aos tampões de gel e incube-os por 10 minutos à temperatura ambiente para permitir que sequem e contraiam. Depois, remova cuidadosamente a acetonitrila e repita com os pedaços de gel.Deve apresentar aparência branca e pequena. Deixe as fatias do gel secarem em um concentrador por 10 minutos. Inche as fatias do gel adicionando 10 microlitros de solução de tripsina ativada.Incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione 25 microlitros de tampão de digestão aos tubos. Incube as amostras à temperatura ambiente durante a noite com agitação, sonique as amostras por 10 minutos e centrifugue antes de transferir o sobrenadante para um tubo novo.Para extrair mais peptídeos, adicione 10 microlitros de ácido fórmico 0,1% aos tampões e incube por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação; sonique as amostras por 10 minutos. Recolha o sobrenadante e combine-o com o sobrenadante previamente armazenado. As proteínas podem então ser dessalinizadas e preparadas para espectrometria de massas acoplada à CLAE. Músculo esquelético de machos e fêmeas não exercitados foi extraído e separado em um mapa bidimensional.O primeiro nível do proteoma comparativo muscular, uma vez visualizado por meio de imagem digital de alta resolução, revelou cerca de 800 pontos proteicos em cada amostra, conforme mostrado aqui. Utilizando o mapa do proteoma masculino como referência, é evidente que existem inúmeros pontos cuja abundância varia no proteoma feminino: pontos que aumentaram em duas vezes ou mais nas fêmeas estão circulados em vermelho, e aqueles que diminuíram em duas vezes ou mais estão circulados em azul. As identidades dos pontos proteicos que variam mais de duas vezes para cima ou para baixo e que são estatisticamente significativos, com N igual a cinco camundongos, são determinadas por análise da sequência de aminoácidos utilizando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas.Neste gráfico, o eixo x representa camundongos fêmeas antes do exercício, e o eixo Y representa um grupo em ponto temporal de zero hora após um único episódio de exercício. Os resultados mostram que as fêmeas demonstram uma acentuada diminuição no metabolismo energético de açúcares, nas enzimas e nas isoformas da enzima creatina quinase, um sistema diferente de fornecimento de energia nos músculos. Tanto humanos quanto animais exibem níveis séricos mais elevados de CK em repouso e após o exercício, mas os níveis séricos de CK não necessariamente se correlacionam com a quantidade de miofibrilas.Esse dimorfismo de gênero na abundância celular da CK no músculo bíceps braquial de miren é uma descoberta inédita e pode explicar os níveis fisiologicamente diferentes de CK sérica. Após este procedimento, outros métodos, como o blot imunológico quantitativo, podem ser realizados para verificar os resultados. Após assistir a este vídeo, deveremos ter uma boa compreensão de como preparar e separar amostras para perfis diferenciais de proteoma.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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