Guiada por MRI rompimento da barreira hemato-encefálica utilizando Ultrassom Focalizado transcraniana em um modelo de rato
13 de março de 2012
Microbolhas mediada ruptura ultra-som focalizado da barreira sangue-cérebro (BBB) é uma técnica promissora para não-invasivo de entrega de drogas alvo no cérebro 1-3. Este protocolo descreve o procedimento experimental para guiada por MRI perturbação BBB transcraniana num modelo de rato.
O objetivo geral deste procedimento é interromper localmente a barreira hematoencefálica, permitindo a passagem de moléculas para o tecido, as quais normalmente estão confinadas à vasculatura cerebral. Isso é realizado primeiramente preparando o animal e posicionando-o em decúbito dorsal sobre um banho de água acima de um transdutor de ultrassom focalizado e um sistema de posicionamento do transdutor em três eixos. O segundo passo do procedimento é adquirir imagens de RNM para fornecer informações de direcionamento ao sistema de posicionamento.
O terceiro passo do procedimento é preparar e injetar a solução de microbolhas. O passo final do procedimento é ajustar os parâmetros de ultrassom e aplicar o ultrassom. Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram a permeabilidade da barreira hematoencefálica nos locais submetidos à sonicação, por meio de ressonância magnética ponderada em T1 com realce por contraste.
As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de distúrbios cerebrais e do sistema nervoso central, pois essa interrupção local e repetível da barreira hematoencefálica permite a investigação de intervenções farmacológicas para condições que anteriormente tiveram pouca resposta à terapia medicamentosa. Em geral, pessoas novas nesse método terão dificuldades, pois a manipulação e injeção das bolhas exige paciência e cuidado para evitar rompê-las antes de alcançarem o alvo. A demonstração do preparo do animal será mostrada em um passeio.
Um técnico do nosso laboratório seleciona um transdutor de ultrassom calibrado apropriado. Em seguida, coloca um banho de água com água desionizada dessonificada sobre a base de um aparelho de ressonância magnética de 1,5 Tesla ou três Tesla, montando o transdutor de ultrassom no tanque sobre uma plataforma ou sistema de posicionamento tridimensional compatível com RM, voltado para a superfície da água. O banho de água deve possuir uma placa superior para acomodar os animais após anestesia com gás isoflurano, além de ter o pêlo da região da cabeça e do pescoço depilado.
Em seguida, remova o pêlo restante usando um creme depilatório. Insira um cateter de calibre 22 com torneira de três vias na veia da cauda e realize uma lavagem com uma mistura de heparina e soro fisiológico para prevenir a formação de coágulos no cateter. Administre anestésicos injetáveis por via intramuscular e remova o animal do isoflurano.
10 minutos antes do início do experimento, aplique uma pequena quantidade de gel ultrassônico no topo da cabeça do animal para minimizar a possibilidade de bolhas de ar aprisionadas. Em seguida, posicione o animal anestesiado em decúbito dorsal no sistema de posicionamento de ultrassom, com o topo da cabeça em contato com o banho de água através de um orifício na placa superior.
A cabeça pode ser mantida no lugar usando uma barra de mordida, se disponível, ou fita fixada firmemente sobre o queixo. Em seguida, prenda as pernas ao sistema de posicionamento. Cubra o animal com uma toalha ou cobertor para mantê-lo aquecido.
Ao longo do experimento, adquira imagens ponderadas em T2 e ponderadas em T1 do cérebro em corte axial, utilizando os parâmetros de aquisição apropriados. Selecione o alvo a partir dos cortes ponderados em T2, evitando os ventrículos e a linha média do cérebro, e escolha uma profundidade no mesencéfalo.
Mova o foco do transdutor para a localização-alvo. Ative microbolhas definitivas de acordo com o protocolo do fabricante e aspire lentamente um pequeno volume para dentro de uma seringa de um mililitro. Utilizando uma agulha de 18 calibres, remova o ar aprisionado da seringa movendo suavemente o êmbolo para frente e para trás, em vez de bater.
Como isso pode romper as microbolhas, dilua as microbolhas em solução salina normal numa proporção de 10 para um, salina para microbolhas, injetando lentamente o volume necessário de microbolhas numa seringa contendo salina. Inverta suavemente a seringa para misturar completamente as microbolhas e a salina até obter uma aparência homogênea. Calcule o volume da dose necessária com base em 0,02 mililitros por quilograma de microbolhas, ou 0,2 mililitros por quilograma da solução.
Na diluição de 10 para um. Ajuste os parâmetros de sonicação utilizando pulsos de baixo ciclo de trabalho em vez de sonicação contínua. Verifique se a cabeça do animal ainda está acoplada à água.
Inicie a sonicação enquanto injeta lentamente as microbolhas no cateter da veia caudal. Em seguida, faça uma lavagem com 0,5 mililitros de soro fisiológico após a sonicação. Injete um agente de contraste para ressonância magnética pelo cateter da veia caudal, seguido por uma lavagem com 0,5 mililitro de soro fisiológico.
Realize uma ponderação em T1 até que o pico de contraste tenha passado. Sonicação. Os locais que foram interrompidos com sucesso mostrarão maior realce do que o tecido circundante. Realize uma ponderação em T2 para verificar a presença de sinal alto nos locais de sonicação, o que indica edema nesses locais.
Imagens típicas de ressonância magnética ponderadas em T1, antes e após o FUST, são mostradas aqui. Uma imagem ponderada em T1 com contraste realça aberturas focais distintas. Quatro localizações sonificadas são exibidas, com as localizações um e dois mostrando realce de contraste particularmente intenso.
Os locais um e dois também mostram alta intensidade de sinal na imagem ponderada em T2 após FUS, indicando edema. A extensão do edema ponderado em T2 às vezes pode ser mais facilmente visualizada em cortes sagitais, como aqui, cortes sagitais ponderados em CET1 e T2 através da sunação. Os locais um e três são mostrados após FUS: o edema é visível no local um, mas não no local três.
A análise espectral dos dados de emissões acústicas capturados pode mostrar emissões harmônicas e/ou subharmônicas e ultraharmônicas quando ocorre cavitação estável. Os dados capturados durante um único estímulo de 10 milissegundos a 551,5 quilohertz mostram a frequência fundamental, bem como harmônicos e subharmônicos e ultraharmônicos. O uso de frequências de sonicão mais altas resulta em aberturas mais localizadas devido ao menor tamanho do ponto focal, conforme mostrado aqui.
Frequências mais altas podem ser usadas para criar regiões menores de abertura, o que permite a investigação do mesencéfalo com menos efeitos próximos ao crânio. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o manuseio cuidadoso dos microbubbles é essencial para obter bons resultados. Uma vez que esta técnica seja aperfeiçoada, os pesquisadores podem começar a responder outras questões, como, qual é a eficácia da entrega de um agente terapêutico a um alvo específico no cérebro?
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para a desintegração não invasiva da barreira hematoencefálica (BHE) utilizando ultrassom focalizado mediado por microbolhas. A técnica tem como objetivo facilitar a entrega direcionada de fármacos no cérebro, demonstrada por meio de procedimentos guiados por ressonância magnética em um modelo de rato.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Engenharia Biomédica
- Sistemas de Liberação de Fármacos
Contexto
- A barreira hematoencefálica (BHE) restringe a passagem de agentes terapêuticos para o cérebro.
- O ultrassom focalizado combinado com microbolhas pode interromper temporariamente a BHE.
- Esse método permite a administração localizada de medicamentos em regiões cerebrais específicas.
- A orientação por ressonância magnética melhora a precisão do processo de interrupção.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para a disruptura da BHE em um modelo ratino.
- Avaliar a eficácia do ultrassom focalizado mediado por microbolhas.
- Verificar a permeabilidade da BHE utilizando técnicas de imagem por ressonância magnética.
Métodos Utilizados
- Preparação do animal e posicionamento acima de um transdutor de ultrassom focalizado.
- Aquisição de imagens de ressonância magnética para direcionamento preciso.
- Preparação e injeção de uma solução de microbolhas.
- Definição dos parâmetros de ultrassom e aplicação do ultrassom para romper a BHE.
Resultados Principais
- Disrupção bem-sucedida da BHE em locais específicos.
- Permeabilidade aumentada observada por meio de ressonância magnética com contraste.
- Demonstração do potencial de liberação localizada de fármacos.
- Validação do protocolo para aplicações terapêuticas futuras.
Conclusões
- A ultrassonografia focalizada mediada por microbolhas é eficaz para a disruptura da BHE.
- Essa técnica apresenta potencial para a entrega não invasiva de fármacos em distúrbios neurológicos.
- São necessários mais estudos para otimizar os parâmetros para aplicações clínicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A ultrassonografia transcraniana focalizada (FUS) com orientação por ressonância magnética permite a interrupção precisa e temporária da barreira hematoencefálica (BHE), abordando um grande gargalo na entrega de fármacos ao sistema nervoso central (SNC). Essa capacidade permite que equipes de pesquisa e desenvolvimento avaliem agentes terapêuticos que, de outra forma, seriam excluídos do tecido cerebral, apoiando a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas. A abordagem é altamente relevante para estratégias de portfólio que buscam avançar ativos para o SNC com maior confiança preditiva.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses terapêuticas para o SNC ao permitir a administração localizada de moléculas candidatas através da BHE.
- Apoia a validação funcional de alvos ao permitir a avaliação direta dos efeitos farmacológicos no tecido cerebral.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas em programas para o SNC ao superar barreiras de administração em modelos pré-clínicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara modelos animais validados para estudos de eficácia e farmacodinâmicos posteriores que exigem exposição ao SNC.
- Padroniza a disruptura da BHE com confirmação por RNM, garantindo reprodutibilidade e avaliação quantitativa da permeabilidade.
- Permite avaliação confiável da penetração encefálica do composto e de seus efeitos localizados em fluxos de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos a perfis de exposição relevantes para doenças no SNC para estudos translacionais de biomarcadores.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo a abertura repetível e localizada da BHE.
- Reduz o risco translacional ao permitir a medição direta da entrega de fármacos ao SNC e da resposta tecidual.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de USF guiado por RMI se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico, conectando a validação inicial de alvos e a pesquisa translacional para ativos do SNC.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a administração direta de agentes experimentais no SNC.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis por RNM da permeabilidade da BHE para estudos comparativos.
- Análises: Fornece dados de imagem e emissão acústica para avaliar o sucesso da desintegração e os efeitos nos tecidos.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento da exposição pré-clínica com os desafios clínicos da administração no SNC.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar in vivo diversas modalidades direcionadas ao SNC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de entrega de fármacos no SNC e de interação com o alvo.
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de disruptura da BHE e de imagem para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar com ativos para o SNC ao reduzir a incerteza sobre a exposição cerebral.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de programas para o SNC com base em dados validados de entrega e mecanismos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em imagem por ressonância magnética, ultrassom focalizado e manipulação de microbolhas para obter resultados ideais.
- Requer acesso a sistemas de ultrassom compatíveis com ressonância magnética e infraestrutura para imagem em animais.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de imagem e parâmetros de sonicação.
- Pode exigir adaptação para diferentes modelos animais ou regiões cerebrais, conforme as necessidades da pesquisa.
- A preparação e injeção cuidadosas das microbolhas são essenciais para evitar falhas técnicas e garantir a reprodutibilidade.
