Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

Olá, Shane, aqui é o Monty do Laboratório Bija. Hoje vou mostrar a você como usar sondas de silício para realizar gravações eletrofisiológicas de alta densidade da atividade de unidades e do potencial de campo local em ratos acordados e em comportamento ativo. Vou mostrar como fabricar um pequeno microdrive, fixar uma sonda de silício a ele e, em seguida, implantar a sonda no cérebro para gravações crônicas.

Esse processo é bastante simples, mas envolve várias etapas. Então, vamos começar. Aqui há uma pequena coleção de microacionadores para ratos e camundongos, projetados e fabricados ao longo dos anos, que movem múltiplos fios individuais, teros e sondas de silício.

As sondas de silício podem ser fixadas em placas de circuito impresso rígidas ou em cabos flexíveis de poliamida. Aqui mostraremos como fixar esta sonda de quatro hastes a um microdrive. Para preparar um drive, precisamos de uma placa de latão, brocas de tamanho 55 e 65, um macho de rosca, um conector de pinos de uma fileira, um parafuso 0 0 90 e sua porca correspondente, um suporte para broca e uma chave de fenda.

O primeiro passo é separar um conector de três pinos do cabeçalho. Retire cuidadosamente o pino central, alargue um orifício perfurando-o com uma broca de tamanho 65. Em seguida, corte uma rosca utilizando o ta.

Corte duas peças da chapa de latão. Afile as bordas da chapa com uma broca Dremel e faça um furo no centro de ambas as peças usando uma broca de tamanho 55. O acionador é montado temporariamente de modo que as chapas de latão toquem os pinos; aperte os parafusos suavemente para que a montagem fique estável.

As pontas dos pinos são inseridas e depois soldadas às placas de latão. O microacionador está quase pronto; lima-se a extremidade saliente do parafuso e solda-se o parafuso. Agora temos um microacionador 2 superleve.

O giro no sentido horário elevará a ponte de plástico. A sonda de silício pode ser fixada ao dispositivo por dois componentes. O elastômero de proteção de seda é levado em consideração.

Misture os componentes em uma proporção de dez para um. Usando um aplicador de algodão afiado, aplique esta proteção na extremidade superior da sonda. Deixe secar em uma estufa pré-aquecida a 60 graus Celsius por pelo menos duas horas.

Para garantir que os locais de gravação estejam livres de qualquer resíduo, as pontas precisam ser limpas. Prepare uma diluição de quatro pessoas do detergente contra. Deixe a sonda de molho no detergente a 63 graus Celsius por pelo menos duas horas.

O detergente deve ser removido lavando a sonda com água destilada, mergulhando-a repetidamente antes de fixar a sonda ao suporte. A impedância de cada local de gravação deve ser verificada usando uma lâmina de barbear. Faça múltiplas ranhuras na ponte para criar uma superfície áspera, utilizando dois micromanipuladores.

O sensor é posicionado oposto à ponte do atuador. Em seguida, o sensor é fixado à ponte com cimento adesivo antes da cirurgia. Os eletrodos de referência e de terra são preparados.

Descasque uma extremidade de um fio de cobre isolado por cerca de um milímetro. Usando uma agulha, lixe a cabeça de um parafuso de aço inoxidável 0 0 90 e solde o fio de cobre a ele. Tenha cuidado para evitar que a solda escorra para o sulco do parafuso.

Corte pedaços trapezoidais da malha de cobre. Essas peças serão montadas para proteger a etapa da cabeça. O instrumental cirúrgico e o preparo são os mesmos utilizados em muitas cirurgias de pequenos animais.

Observe que a cirurgia mostrada neste vídeo é apenas para fins de demonstração, com o objetivo de proporcionar boa visibilidade e facilitar a filmagem. Várias etapas preparatórias, precauções cirúrgicas e procedimentos pós-operatórios não são mostrados aqui. Consulte as diretrizes apropriadas para cirurgia em roedores.

Toda a cirurgia é realizada sob anestesia com gás e em condições sépticas. Após a incisão mediana da pele, a pele e o periósteo são removidos e o crânio é limpo e seco. A localização e a distância entre bregma e lambda são medidas, para que as coordenadas X e Y da posição possam ser determinadas e marcadas no crânio antes de abri-lo.

Para implantar a sonda, diversos parafusos são parcialmente inseridos no osso, tanto na parte superior quanto na lateral, e orifícios também são preparados acima do crânio para inserir os eletrodos. Múltiplos parafusos são essenciais para fixar o estágio cefálico ao crânio em experimentos crônicos de longo prazo. Usando uma pequena escova, aplique meta sobre o ativador da dentina em toda a superfície do crânio.

Em seguida, enxágue com soro fisiológico. Depois, aplica-se cuidadosamente uma camada de cimento dental cobrindo uma equipe de corrente. As quatro abas de cobre são então fixadas a este crânio com cimento adesivo.

Agora chegamos à parte mais crítica da cirurgia. O preparo do local de implante da sonda utilizando uma broca de ponta redonda. A perfuração é realizada em múltiplas etapas e o osso é frequentemente irrigado com solução salina.

O retalho ósseo é cuidadosamente removido e a superfície é irrigada para eliminar a zura. Dois instrumentos são necessários. O gancho preparado a partir de uma agulha de inseto e uma lâmina afiada levantam e cortam o tecido, com pequenos sangramentos que podem ser resolvidos mediante irrigação com solução salina.

Se ocorrer sangramento grave ou se o neocórtex for comprometido de alguma forma, deve-se considerar a interrupção da cirurgia e o preparo de outro animal. Agora estamos implantando a sonda de silício. A sonda deve ser inserida em uma área livre de vasos, enquanto a hemostasia é realizada para resolver sangramentos menores.

O probe é colocado aproximadamente um milímetro acima do alvo pretendido. O to é fechado aplicando-se uma mistura quente derretida de parafina e óleo mineral. A base do drive está no crânio de Cortes com cimento adesivo.

A parte de conexão da sonda é fixada de maneira semelhante ao crânio. O estágio final e crítico da cirurgia é montar abas de malha de cobre formando um cilindro protetor ao redor da sonda e do mecanismo de avanço. O cilindro também serve como uma blindagem elétrica contra ruídos ambientais e artefatos de ondas lentas produzidos pelos vibrissas carregados.

No animal em movimento, a altura pode ser ajustada cortando o material em excesso. O fio do referencial em massa é soldado aos pinos apropriados do conector. A massa também é soldada à malha de cobre.

As abas de cobre são conectadas por soldagem e reforçadas com cimento. O movimento do parafuso de acionamento é testado novamente ao final da cirurgia, com um suporte para a cabeça equipado com um pedaço cortado de uma luva de borracha após os cuidados pós-operatórios adequados. Trata-se de um animal saudável e cooperativo que se apresenta muito bem no dia seguinte.

Para permitir o livre movimento do animal, recomendamos o uso de um cabo multicanal ultraleve e ultraflexível. O cabo leve exige contrapeso mínimo e permite movimento irrestrito. A qualidade da gravação é testada diariamente na gaiola de alojamento.

A posição do local de gravação é estimada por meio dos padrões de disparo das unidades e da forma dos potenciais de campo locais. Nosso vídeo mostra a implantação de uma única sonda de silicone, mas gravações em múltiplos locais utilizando várias sondas e dispositivos podem ser facilmente realizadas após alguma prática. Também estamos utilizando dispositivos semelhantes, porém menores, para implantar sondas de silicone no cérebro do camundongo.

Por fim, as gravações com sondas de silício podem ser efetivamente combinadas com estímulo luminoso local do tecido neural em experimentos optogenéticos. Obrigado por assistir.