Name: Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a determinar a atividade fagocítica de anticorpos em amostras clínicas usando citometria de fluxo de alta vazão. Este método utiliza micropartículas fluorescentes revestidas com antígenos e células monocíticas THP-1.

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Os autores gostariam de agradecer financiamento do NIH 3R01AI080289-02S1, e Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship sob NIH / NIAID 2P30AI060354-07.

1. As células fagocíticas cultura <ol><li> Cultura de células THP-1 10 em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino como uma suspensão estacionária em frascos T. Densidade celular deve ser mantida abaixo de 0.5x10 6 mL / a fim de manter níveis consistentes de expressão FcγR e desempenho do ensaio. </li></ol> 2. Prepare antígeno biotinilado <ol><li> Calcular a quantidade de sulfo-NHS kit reagente LC biotina necessário biotinylate o antígeno alvo de interesse de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Dissolver o reagente Biotinilação em água e imediatamente adicionar o montante calculado ao antígeno em um buffer que não contém aminas primárias. Permitir que a reação continue por 1 hora em temperatura ambiente, mexendo ocasionalmente. </li><li> Remover biotina, o excesso não conjugada por troca de buffer em uma unidade de concentração Amicon centrífuga de um corte de peso molecular apropriada para reter o targeantígeno t. Adicione a amostra para a câmara superior da unidade de concentração e adicione PBS para levar o volume total de até 15 mL linha de enchimento. Centrifugar a 4.000 xg para trazer volume para cerca de 1,5 mls. Repetindo este processo duas vezes irá remover 99% da biotina livre para garantir a cobertura máxima de antígeno para contas. </li></ol> 3. Prepare Beads Antígeno Saturada <ol><li> Lavar 100 l de 1 mm contas neutravidin fluorescentes duas vezes em 1 ml de 0,1% PBS-BSA após girar para baixo em uma microcentrífuga em alta velocidade. Ressuspender lavados contas em 100 l PBS-BSA, e alíquota em 10 tubos. </li><li> Para determinar as condições de antígeno revestimento que saturam as contas, combine 10 ul da suspensão lavados talão com concentrações variando de antígeno biotinilado em duas vezes passos. Incubar overnight a 4 ° C em um tubo de microcentrífuga em um rotador. </li></ol> NOTA: Saturação de contas devem ser determinadas experimentalmente. Isso pode ser feitoidentificando-revestimento talão condições que produzem fagocitose máximo quando contas são posteriormente opsonizadas com um anticorpo monoclonal controle. <ol start="3"><li> Remover antígeno não ligado por lavagem com 1 mL de PBS-BSA e centrifugar em alta velocidade até contas são peletizadas. Remover PBS-BSA e repita. </li><li> Ressuspender antígeno revestido contas em um volume final de 1 ml em PBS-BSA. Contas pode ser armazenado por até uma semana a 4 ° C antes do uso. </li></ol> 4. Prepare amostras de anticorpos <ol><li> Amostras clínicas de anticorpos pode ser purificado a partir do plasma usando um gel Melon kit de purificação de IgG de acordo com as instruções dos fabricantes. IgG purificada pode ser armazenado a 4 ° C até que esteja pronto para uso. </li></ol> NOTA: as devidas precauções ao manusear amostras humanas devem sempre foram tomadas. <ol start="2"><li> Determinar a concentração de anticorpos purificados por absorvência a A280, e diluir as amostras a 1 mg / ml em PBS. </li><li> Prepare positive e negativos anticorpos monoclonais controle por diluição de 1 mg / ml em PBS. </li></ol> 5. Chapeamento do Experimento <ol><li> Ressuspender o lavado, o antígeno solução saturada talão preparada acima em vortex, e transferir 10 ml em cada poço de um de fundo redondo de 96 placa também. Cuidados devem ser tomados para melhorar continuamente a agitar a suspensão de esferas para assegurar igual número de partículas fluorescentes são adicionados a cada poço. </li><li> Adicionar diferentes concentrações dos anticorpos de interesse de cada bem, criando uma curva dose-resposta para cada anticorpo. Concentrações ideais será diferente entre as amostras, dependendo da titulação de anticorpos presente, mas uma gama de 0,01-100 mcg / ml concentração final irá proporcionar uma boa cobertura e permitir a identificação da faixa de concentração de interesse. Garantir anticorpos são adicionados em volumes não maior do que 20 l. </li><li> Contas de incubar e amostras de anticorpos para 2 horas a 37 ° C para permitir que os anticorpos para opsonize as contas. &lt;/ Li&gt; <li> Prepare uma suspensão de células THP-1 a 2,5 x 10 5 células / ml, e adicionar 200 mL da suspensão a cada poço, para um total de 5 x 10 4 células THP-1 em cada poço. </li><li> Incubar durante a 37 ° C, 5% CO 2, em uma incubadora estacionária, permitindo que as células e os grânulos de pellet através da gravidade. </li></ol> NOTA: Sinal de ruído pode ser melhorada através da determinação do talão ideal: anticorpo: THP-1 índices de células para uma fonte de antígeno-anticorpo dado. 6. Análise por citometria de fluxo <ol><li> Remova 100 ul de sobrenadante de cada poço com cuidado para não perturbar o pellet celular. Sobrenadante podem ser salvas se as determinações de citocinas secreção ou outras análises são desejados. </li><li> Para fixação, adicione 100 ml de paraformaldeído 4% a cada poço e pipeta para ressuspender as células e misture. </li><li> Análise de fluxo de alta vazão citometria pode ser realizada utilizando uma BD LSR II equipado com um leitor de placas HTS.</li><li> Software programa para misturar todos os poços três vezes (100 mL de volume mix) e analisar 30 mL, ou pelo menos 2.000 eventos de células, de cada amostra. </li><li> Os dados coletados podem ser analisados ​​no programa FlowJo ou software equivalente. Métricas úteis incluem o percentual de + talão, ou células fluorescentes, que fornece uma medida do número de células fagocíticas presentes, bem como a intensidade de fluorescência das células fagocíticas, que fornece uma medida do número de contas fagocitados. Multiplicando esses valores gera uma intensidade média integrada fluorescentes ou iMFI. </li><li> O número médio de grânulos fagocitados por cada célula fagocítica pode ser calculado dividindo o iMFI pela fluorescência média de um talão. </li></ol> 7. Resultados representante Deve haver uma diferenciação clara de amostras de anticorpos de indivíduos afetados e não afetados. Figura 1A apresenta os histogramas FACS de uma amostra de um anticorpo nega HIVtiva (traço preto) e um sujeito HIV positivo (traço cinza), e demonstra a fagocitose aumentou impulsionada pela presença de antígeno-anticorpos específicos. Ótima sensibilidade do ensaio é dependente de saturação das contas com o antígeno biotinilado. Figura 1B apresenta a fagocitose observado quando grânulos revestidos com diferentes quantidades de antígeno foram opsonizadas com 3 anticorpos monoclonais controle (incluindo um anticorpo não vinculativo, triângulos), e estabelece 2μg antígeno / mL contas como uma concentração de saturação para este antígeno. A curva dose-resposta é apresentada na Figura 2, e demonstra a capacidade diferencial de amostras de anticorpos assunto para induzir fagocitose em uma faixa de concentração de anticorpos de 0,05-5 mcg / ml. Este fagocitose diferencial pode ser movida por qualquer diferença no título ou propriedades de domínio Fc como subclasse IgG e estadual de glicosilação. Quando células THP-1 são imaged por microscopia fluorescente, há clara evidência de fagocitose talão. A Figura 3 apresenta duas imagens estáticas 63x de células THP-1 após a incubação com o anticorpo opsonizadas (verde) e não-opsonizadas (vermelho) contas, demonstrando a falta de absorção fagocíticas na ausência de anticorpos. Quando a microscopia de lapso de tempo é realizada, a absorção de anticorpos específicos fagocítica de partículas fluorescentes é ainda mais impressionante (Movie 1, ampliação de 20x). Trabalho anterior confirmou interiorização das contas associadas com as células, e experimentos com monócitos primários concordaram bem com os índices de fagocitose (valores iMFI) neste ensaio alta taxa de transferência (dados não mostrados). <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Controle de Qualidade de Ensaio. 1A, histogramas citometria de fluxo de fagocitose de uma amostra de anticorpos a partir de um tema HIV negativo (traço preto) e um sujeito HIV positivo (traço cinza).1B: determinação experimental do óptimas condições de revestimento talão para um antígeno da amostra. Antígeno-anticorpos monoclonais específicos (círculo, quadrado) demonstram fagocitose máxima de contas revestidas com&gt; 2 mg de antígeno / mL de contas, enquanto um anticorpo de controle (triângulo) demonstra nenhuma atividade fagocítica. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Fagocitose curva dose-resposta. Clínica amostras de anticorpos HIV positivo (tratado, tratado, e exibindo controle da replicação viral na ausência de anti-retrovirais) e fagocitose disco HIV negativo assuntos da gp120 (envelope HIV) grânulos revestido de forma diferenciada. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Internalização eficiente. Microscopia confirma a internalização de anticorpos opsonizadas contas (verde), enquanto os não-opsonizadas contas permanecer no solution (63x ampliação). Movie 1. Time-lapse de microscopia de anticorpos dirigidos a fagocitose foi realizado ao longo de 14 horas e permite a visualização da atividade das células fagocíticas THP-1 utilizados no ensaio de alto rendimento. Verde partículas fluorescentes são o anticorpo opsonizadas, vermelho partículas fluorescentes fornecer um controle negativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3588/3588movie1.mov">Clique aqui para assistir o filme.</a>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio aqui descrito permite high-throughput análise da atividade fagocítica de amostras clínicas de anticorpos, utilizando uma linha celular monocítica muito utilizada para estudar os processos fagocíticas 10 e placa de citometria de fluxo baseado automatizado. Este ensaio é vantajoso sobre os outros em sua capacidade de caracterizar precisamente subconjuntos antígeno-anticorpo específico, permitindo não só para o estudo das diferenças de fagocitose impulsionado pela doença de anticorpos específicos de diferentes disciplinas, mas também estudar as especificidades de antígenos múltiplos dentro do mesmo assunto. Porque o recrutamento de anticorpos de células efetoras inata, como monócitos e células antígeno apresentando outros impactos fortemente a evolução da doença 11-13, e é biologicamente variável, dependendo da geometria de anticorpos, subclasse IgG, e glicosilação em Asparagine297 do domínio Fc 14-16, este método prevê avaliação de um mecanismo de anticorpos críticos da ação. Além disso, como medi-anticorpofagocitose ated é explorada por alguns patógenos durante o curso da infecção 7,17,18, este ensaio é uma promessa na avaliação do processo de dependente de anticorpos acessório, e destaca a natureza dual da fagocitose como potencialmente protetor, bem como potencialmente prejudiciais atividade de anticorpos. O ensaio descrito pode ser utilizado para analisar os anticorpos a partir de amostras clínicas de populações de pacientes, mas também dos vacinados e podem ser adaptadas para utilizar soro em vez de IgG purificada. Além disso, a secreção de citocinas em resposta a fagocitose pode ser analisado a partir do sobrenadante da cultura, ea influência de FcR específico pode ser determinado usando FcR-anticorpos bloqueadores, permitindo não só as diferenças de potência fagocíticas a ser determinado, mas a jusante de sinalização de eventos, com uma visão em mecanismo, e pode ajudar a resolver e aperfeiçoar a compreensão deste mecanismo imunológico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> EZ-Link Micro sulfo-NHS-LC-Biotinilação Kit </td><td> Thermo scientfic </td><td> 21935 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Unidade Centrífuga de filtro com membrana Ultracel-50 </td><td> Millipore </td><td> UFC905024 </td><td> Tamanho da unidade de filtro pode variar de acordo com o tamanho do antígeno </td></tr><tr><td> FluoSpheres NeutrAvidin rotulados microesferas, 1,0 mM, amarelo-verde fluorescente (505/515) </td><td> Invitrogen </td><td> F-8776 </td><td> Fabricantes produzem este produto em várias cores </td></tr><tr><td> Melão Gel Kit de Purificação de IgG </td><td> Thermo </td><td> 45212 </td><td> Cuidados devem ser tomados para verificar a pureza das amostras Ab por SDS-PAGE. </td></tr></tbody></table>

determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos clínica

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Anticorpo-driven fagocitose é induzida através do envolvimento de receptores Fc em fagócitos profissionais, e pode contribuir tanto para a depuração, bem como a patologia da doença. Enquanto as propriedades dos domínios variáveis ​​de anticorpos têm sido considerados cruciais para função in vivo, a capacidade de anticorpos para recrutar células do sistema imunológico inato via seus domínios Fc tornou-se cada vez mais apreciada como um fator importante para sua eficácia, tanto no cenário de recombinante terapia com anticorpos monoclonais, bem como no curso da infecção natural ou vacinação 1-3. Importante, apesar de sua nomenclatura como um domínio constante, o anticorpo de domínio Fc não tem função constante, e é fortemente modulada por subclasse IgG (IgG1-4) e glicosilação de asparagina 297 4-6. Assim, este método para estudar as diferenças funcionais de antígeno-anticorpos específicos em amostras clínicas facilitará correlação do pote fagocíticaspreferencial de anticorpos para a susceptibilidade à doença do Estado, à infecção, a progressão ou evolução clínica. Além disso, esta função efetora é particularmente importante à luz da capacidade documentado de anticorpos para aumentar a infecção através do acesso patógenos em células hospedeiras através de fagocitose receptor Fc-driven 7. Além disso, há algumas evidências de que a captação fagocitária de complexos imunes podem afetar a polarização Th1/Th2 da resposta imune 8. Aqui, descrevemos um teste desenvolvido para detectar diferenças de anticorpos induzida pela fagocitose, que pode ser causada pelo diferencial de subclasse IgG, estrutura de glicano de Asn297, bem como a capacidade de formar complexos imunes de antígeno-anticorpos específicos de uma forma de alto rendimento . Para este fim, 1 mícron partículas fluorescentes são revestidas com antígeno, em seguida, incubadas com amostras clínicas de anticorpos, gerando fluorescente antígeno específico complexos imunes. Estes Antibody-opsonizadas grânulos são então incubadas com uma linha celular monocítica expressar FcγRs múltiplas, incluindo tanto inibitórios e ativar. Saída de ensaio pode incluir atividade fagocítica, secreção de citoquinas e padrões de uso FcγRs, e são determinados de forma padronizada, tornando este um sistema altamente útil para a análise de diferenças nesta função dependente de anticorpos efetoras em ambas as infecções e vacinas mediada protecção 9.

Nós apresentamos um ensaio de fluxo de alto rendimento por citometria de determinar a atividade fagocítica de antígenos-anticorpos específicos a partir de amostras clínicas, utilizando antígenos fluorescentes revestido contas e uma linha celular monocítica expressar múltiplos receptores Fc-proporcionando o uso do receptor e determinações atividade fagocitária em um padronizados e forma reproduzível para qualquer antígeno de interesse.

Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica

A fagocitose mediada por anticorpos é induzida através do engajamento de receptores Fc em fagócitos profissionais e pode contribuir tanto para a depuração quanto para...

O objetivo do seguinte experimento é determinar a atividade fagocítica de anticorpos específicos para antígenos em amostras clínicas com alto rendimento. Isso é alcançado primeiramente recobrindo microesferas fluorescentes com um antígeno de escolha, permitindo a captura da fração de anticorpos específica para o antígeno presente em amostras complexas de anticorpos clínicos. Em um segundo passo, células TP1 fagocíticas são incubadas com as microesferas fluorescentes ionizadas, que então fagocitam as microesferas conforme impulsionado pelo número e pelas características do domínio FC dos anticorpos ligados.Em seguida, a intensidade de fluorescência das células THP-1 é determinada por citometria de fluxo baseada em placas de alto rendimento, a fim de quantificar a atividade fagocítica dos anticorpos presentes na amostra. Em última análise, pode-se avaliar a capacidade dos anticorpos específicos para o antígeno na amostra de induzir fagocitose com base na captação diferencial de microesferas fluorescentes opsonizadas, devido à variação na titulação dos anticorpos ou na reconhecimento variável pelos receptores de anticorpos expressos nas células fagocíticas. As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como aqueles que utilizam células fagocíticas primárias, são o aumento do rendimento e a melhoria na padronização.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a imunologia básica da resposta imune adaptativa, como se diferentes esquemas vacinais induzem anticorpos com atividades distintas. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento de doenças infecciosas, pois os anticorpos contribuem significativamente para o estabelecimento de uma resposta imune protetora eficaz. Embora tenhamos utilizado este método para obter informações sobre a atividade de anticorpos na infecção progressiva pelo HIV e na vacinação, ele também pode ser aplicado a outros estados patológicos, como influenza, autoimunidade e dengue, nos quais anticorpos fragmentados podem agravar a doença D em vez de conferir proteção.Inicie diluindo o antígeno em um tampão que não contenha aminas primárias. Em seguida, dissolva o reagente sulfa NHS lc, biotina em água. Depois, adicione imediatamente o reagente hidratado ao antígeno e deixe a reação prosseguir por uma hora à temperatura ambiente, sob agitação.Ocasionalmente, quando a reação estiver completa, adicione a amostra à câmara superior de uma unidade de concentração centrífuga para remover qualquer biotina não conjugada em excesso por meio de troca de tampão. Agora, adicione PBS para elevar o volume total até a marca de 15 mililitros. Por fim, centrifugue a amostra a 4.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius até que o volume seja reduzido a aproximadamente 1,5 mililitro.Repita este passo três vezes para obter remoção quase quantitativa do biotina livre. Após centrifugar 100 microlitros de microesferas fluorescentes de um mícron de eutradina em uma microcentrífuga a 13.000 × g durante cinco minutos, re-suspenda e lave as microesferas em um mililitro de P-B-S-B-S-A 0,1% seguindo o mesmo procedimento de centrifugação. Em seguida, após ressuspender as microesferas lavadas em 100 microlitros de P-B-S-B-S-A, distribua igualmente as microesferas em 10 tubos de microensaio de 10 microlitros.Em seguida, combine 10 microlitros da suspensão de microesferas lavadas com concentrações variadas de antígeno biotinilado em etapas de diluição. Incube então as suspensões de microesferas e antígeno durante a noite a quatro graus Celsius em um tubo de microcentrífuga sobre um agitador rotativo. No dia seguinte.Remova qualquer antígeno não ligado lavando as suspensões duas vezes com um mililitro de P-B-S-B-S-A e centrifugue as amostras em alta velocidade, como antes, até que as microesferas sejam pelotizadas. Por fim, ressuspenda as microesferas revestidas com antígeno em um volume final de um mililitro de P-B-S-B-S-A após purificar as amostras de anticorpos clínicos do plasma utilizando um kit de purificação de IgG com gel de melon. De acordo com as instruções do fabricante, determine a concentração dos anticorpos purificados por absorbância em 280 nm.Em seguida, dilua os anticorpos para um miligrama por mililitro em PBS, separando amostras para os anticorpos monoclonais de controle positivo e negativo também. A seguir, ressuspenda a solução de perlas saturadas com antígeno por meio de vortex e, então, transfira 10 microlitros da solução para cada poço de uma placa de 96 poços com fundo redondo, tomando o cuidado de agitar continuamente a suspensão de perlas para garantir que números iguais de perlas fluorescentes sejam adicionados a cada um dos poços. Crie uma curva de resposta dose-dependente para cada anticorpo controle adicionando concentrações variadas dos anticorpos de interesse em volumes não superiores a 20 microlitros a cada um.Agora, incubar as amostras de microesferas e anticorpos por duas horas a 37 graus Celsius para permitir que os anticorpos se liguem às microesferas logo antes de as microesferas serem finalizadas. Incubar diluindo uma amostra de células THP-1 a 2,5 vezes 10⁵ células por mililitro em meio. Em seguida, adicionar 200 microlitros das células a cada uma.Por fim, incubar as células com as microesferas recobertas com anticorpo durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em um incubador estacionário, permitindo que as células e as microesferas sedimentem por gravidade. No dia seguinte, remover 100 microlitros do sobrenadante de cada poço, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. Fixar as células em 100 microlitros de paraformaldeído a 4%, e então pipetar para ressuspender e misturar as células.Agora, carregue a placa no leitor de placas de HTS de um citômetro de fluxo de alto rendimento, permitindo a coleta automatizada de dados. A intensidade de fluorescência de uma célula HTHP é capturada e registrada. Essa intensidade de fluorescência é então utilizada para determinar o número de microesferas fagocitadas por cada célula, o que define a atividade fagocítica da amostra de anticorpo em teste.Deve haver uma clara diferenciação entre as amostras de anticorpos de indivíduos afetados e não afetados. Nesta figura, o histograma de frequência de uma amostra de anticorpo de um indivíduo negativo para HIV, representado pelo traço preto, e de um indivíduo positivo para HIV, representado pelo traço cinza, demonstra o aumento da fagocitose induzido pela presença de anticorpos específicos para o antígeno.A sensibilidade ideal deste ensaio depende da saturação das microesferas com antígeno biotinilado, conforme observado aqui. Determinou-se que dois microgramas de antígeno por microlitro de microesferas correspondem à concentração de saturação para este antígeno. Esta curva de resposta à dose demonstra a capacidade diferencial de amostras de anticorpos de indivíduos em induzir fagocitose ao longo de uma faixa de concentração de anticorpos de 0,05 a cinco microgramas por mililitro.Essa fagocitose diferencial pode ser provocada por diferenças no título ou nas propriedades do domínio FC, tais como a subclasse de IgG ou o estado de glicosilação. Quando células TP one são observadas por microscopia fluorescente, há evidência clara de fagocitose de microesferas. Esta imagem fixa de células TP one após incubação com microesferas opsonizadas com anticorpo em verde e microesferas não opsonizadas em vermelho demonstra a ausência de captação fagocítica na ausência de anticorpo, já que apenas as microesferas verdes foram internalizadas pelas células TP one.Quando se realiza microscopia com lapso de tempo, a captação fagocítica específica de microesferas fluorescentes mediada por anticorpos é ainda mais evidente. As microesferas verdes fluorescentes vistas aqui estão ionizadas por anticorpos. As microesferas vermelhas fluorescentes servem como controle negativo. Após este procedimento, outros testes da função dos anticorpos podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre as características da resposta imunológica mediada por anticorpos contra infecção ou vacinação.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a atividade fagocítica de amostras de anticorpos utilizando citometria de fluxo de alto rendimento. Não se esqueça de que o trabalho com amostras clínicas de sangue e plasma pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de equipamento de proteção individual adequado e o seguimento de procedimentos seguros de manipulação, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

determining-the-phagocytic-activity-of-clinical-antibody-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O vídeo mostra um ensaio de morte opsonofagocítica in vitro usando uma co-cultura de neutrófilos humanos com Streptococcus pneumoniae. Anticorpos e proteínas do complemento facilitam a opsonização da bactéria, permitindo que os neutrófilos reconheçam e matem bactérias, mostrando atividade opsonofagocítica de neutrófilos bem-sucedida.

Avaliação da atividade de morte opsonofagocítica contra patógenos bacterianos

Este vídeo demonstra um ensaio de fagocitose baseado em citometria de fluxo envolvendo eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum marcados e opsonizados por monócitos. A citometria de fluxo identifica fluorescência em monócitos, confirmando a identificação bem-sucedida de eritrócitos opsonizados por meio de fagocitose.

Um ensaio para quantificar a fagocitose mediada por anticorpos de eritrócitos infectados por parasitas

Este vídeo mostra um ensaio de monocamada de monócitos utilizando monócitos primários do sangue periférico para avaliar a fagocitose mediada por receptor Fcγ com glóbulos vermelhos R2R2 opsonizados por anticorpos poli D.

Um ensaio para estudar a fagocitose induzida pelo receptor Fcγ em monocamadas de monócitos

Este vídeo demonstra um ensaio para medir a fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) por fagócitos do leite materno. Microesferas marcadas com fluorescência conjugadas a um complexo antígeno-anticorpo são combinadas com uma suspensão celular isolada do leite materno para induzir a fagocitose celular dependente de anticorpos pelos leucócitos fagocíticos. Ao marcar as células com anticorpos contra o antígeno leucocitário comum (CD45), a citometria de fluxo é usada para medir a...

Um ensaio in vitro para medir a fagocitose celular dependente de anticorpos por fagócitos

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

O pH fagossômico influencia a maturação do fagossomo, a produção de oxidantes, a morte fagossômica, bem como a apresentação do antígeno. Aqui descrevemos um método raciométrico para medir as mudanças de pH no curso do tempo e no ponto final em fagossomos individuais em fagócitos vivos usando microscopia de fluorescência.

Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

O ensaio de monocamada de monócitos (MMA) é um ensaio in vitro que utiliza monócitos primários isolados obtidos de sangue total periférico de mamíferos para avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcγ (FcγR).

Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy

O leite materno transmite o vírus da imunodeficiência humana (HIV), embora apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV sejam infectados. Lactentes amamentados ingeriram ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora essas células sejam subestudadas. Aqui nós descrevemos a isolação de leucócito do leite de peito e uma análise de sua capacidade fagocitária.

Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

O objetivo geral deste protocolo é fornecer instruções sobre como medir a capacidade dos anticorpos presentes no soro ou plasma de indivíduos, naturalmente expostos à infecção por Plasmodium falciparum, para opsonizar e induzir fagocitose dos eritrócitos infectados por parasitas (IEs).

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

Descrevemos uma abordagem de molécula única para medições de afinidade antígeno-anticorpos usando fotometria em massa (MP). O protocolo baseado em MP é rápido, preciso, usa uma quantidade muito pequena de material, e não requer modificação de proteína.

Determinação rápida da afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa

Desenvolvemos aprimoramentos e atualizamos métodos para o ensaio monocito-monocamada (MMA) existente, no qual os macrófagos são usados para ajudar a prever melhor a relevância clínica dos aloanticorpos de glóbulos vermelhos na medicina transfusional e imunologia. Este ensaio é denominado ensaio de monócitos-macrófagos (M-MA).

Previsão da significância do anticorpo eritrocitário usando o ensaio de monócitos-macrófagos

Aprenda a determinar a atividade fagocítica de anticorpos em amostras clínicas usando citometria de fluxo de alta vazão. Este método utiliza micropartículas fluorescentes revestidas com antígenos e células monocíticas THP-1.

Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica

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