Em células vivas, imagens de células que expressam proteínas fluorescentes Migrando-marcado em uma matriz tridimensional

Esta demonstração tem como objetivo imaginar proteínas marcadas com fluorescência em células vivas em uma matriz 3D. Primeiro, gere linhagens celulares estáveis que expressem proteínas marcadas com fluorescência. Semeie essas células em uma matriz de colágeno 3D e, em seguida, adquira imagens com lapso de tempo de células migratórias utilizando um microscópio confocal.

No final, os resultados iluminam a localização e a dinâmica de proteínas em células migratórias por meio de imagens com lapso de tempo e análise de FP, observando a dinâmica e a localização proteicas em 3D e em tempo real. Oferece um caminho para responder questões fundamentais sobre migração celular. Por exemplo, como os contatos adesivos são regulados por proteínas citoplasmáticas?

E também como esses contatos são perturbados por inibidores específicos. Em uma cultura de células em placa P 35 com 80 a 90% de confluência, transfecte as células com o plasmídeo de interesse utilizando lipo 2000 conforme as instruções do fabricante. Em seguida, coloque as células em uma incubadora.

No dia seguinte, divida as células em duas placas de Petri de 150 mm e incube durante a noite. Reponha o meio adicionando 50 microgramas por mililitro de G418. Continue o cultivo sob seleção com antibiótico por duas semanas.

Examine o cultivo em busca de colônias resistentes à G quatro 18. Em seguida, utilizando um microscópio fluorescente invertido, identifique e marque as colônias positivas para GFP.

Lave as células duas vezes com PBS. Após a segunda lavagem, deixe uma fina camada de líquido para evitar que as células sequem em cada colônia marcada. Limpe o mais próximo possível da borda com um cotonete esterilizado e pipete 10 microlitros de tripsina sobre a colônia.

Repita rapidamente para cada colônia. Em seguida, incube a placa a 37 graus centígrados para destacamento celular. Verifique a aparência arredondada ao microscópio.

Adicione 10 microlitros de tripsina sobre cada colônia, pipete para destacar completamente as células da placa. Em seguida, transfira cada colônia de células para um único poço de uma placa de cultura de 24 poços para amplificar colônias estáveis. A seguir, avalie a expressão proteica das colônias utilizando western blot padrão e imunofluorescência.

Expanda a modificação da superfície das linhagens celulares selecionadas no vidro. O fundo do recipiente proporciona ligação ótima ao colágeno. Pipete 300 microlitros da solução de silanização na porção de vidro de cada recipiente P 35 com abertura de 10 milímetros.

Incubar por uma hora à temperatura ambiente. Aspirar a solução e lavar com água filtrada três vezes, durante 10 minutos cada. Remover a água e colocar as placas em uma placa aquecida a 50 graus centígrados por 1,5 hora.

Posicione as tampas dos recipientes ligeiramente afastadas dos recipientes para permitir a secagem. Após os recipientes secarem e esfriarem, pipete 300 microlitros de solução de glutaraldeído 2% sobre a parte de vidro de cada recipiente. Incube por uma hora, depois lave com PBS três vezes, durante 10 minutos cada.

Prossiga com a esterilização dos recipientes mediante exposição à luz UV por uma hora. Primeiro, pelote 100 microlitros de partículas fluorescentes marcadoras por centrifugação. Descarte o sobrenadante e re-suspenda as partículas em 500 microlitros de meio.

Realize cinco lavagens, depois re-suspenda as partículas em 30 microlitros de meio. Em seguida, recolha as células que expressam GFP utilizando tripsina e prepare uma suspensão de 2 milhões de células por mililitro em um tubo einor. Pipete 240 microlitros de meio de crescimento. Adicione 12,6 microlitros de heaps um molar, 20 microlitros de água filtrada, 50 microlitros de solução celular e 10 microlitros das partículas fluorescentes.

Por fim, adicione 167 microlitros de colágeno de derme bovina e misture bem a solução. Transfira agora 80 microlitros para a porção de vidro da placa silanizada preparada. Incube a 37 graus centígrados por 50 minutos para que o gel polimerize.

Em seguida, adicione cuidadosamente dois mililitros de meio de crescimento. Equilibre a câmara do microscópio a uma temperatura constante de 37 graus centígrados e reponha o meio celular. Para manter um pH neutro para a imagem em contraste de interferência diferencial (DIC), substitua a tampa do recipiente por uma tampa de vidro com uma fina faixa de paraforma.

Cubra o lado da placa para prevenir evaporação ao usar um objetivo para imersão em óleo. Coloque uma gota de líquido de imersão na posição do objetivo. Posicione o gel de colágeno contendo a placa na platina do microscópio de forma que a placa entre em contato com o líquido de imersão.

Foque a amostra e procure células de interesse para imagem, a fim de minimizar a deriva da platina. Deixe o recipiente assentar por cerca de 45 minutos. Antes de iniciar uma captura prolongada, especifique os parâmetros de aquisição de imagem para experimentos com adição de inibidores.

Prepare o meio suplementado com o fármaco em uma concentração trabalhista desejada. Reponha o meio celular para manter um pH neutro, mas não selar com perfil. Transfira a amostra para o microscópio e prossiga com a aquisição de imagens no momento do tratamento com o fármaco.

Pare a imagem, capture e remova cuidadosamente a tampa do recipiente sem perturbar o recipiente. Aspire o meio e pipete o meio contendo a droga para dentro do recipiente. Em seguida, recoloque cuidadosamente o recipiente.

A configuração superior do frap varia entre os sistemas. Portanto, consulte as instruções do fabricante. Primeiro, defina os parâmetros para a imagem de células vivas.

Para o fotobranqueamento. Teste esses parâmetros em células de prática para obter potência de laser suficiente para fotobranquear o sinal fluorescente sem danificar a célula. Em seguida, inicie a captura de imagens na amostra, adquirindo pelo menos cinco quadros.

Em seguida, faça a fotobranqueamento da região de interesse. Continue a capturar imagens ao longo do tempo de recuperação. Meça a intensidade fluorescente média da área submetida ao fotobranqueamento antes e depois do procedimento ao longo do tempo, utilizando um software de análise estatística.

Ajuste a curva de recuperação à equação exponencial. Obtenha os parâmetros de tempo de meia-vida e intensidade final a partir da curva de ajuste exponencial. Em seguida, calcule a fração móvel tomando a razão entre as intensidades de fluorescência final e inicial.

Essas imagens de células vivas em 3D mostram células epiteliais saudáveis expressando actina GFP. Após quatro dias de cultivo, essas células formaram um cisto em uma matriz colágena tridimensional. Algumas células migraram ao longo da superfície do cisto, enquanto outras migraram no interior do cisto.

A deformação da matriz como resultado das forças de tração exercidas por células migratórias é analisada por meio do deslocamento de partículas traçadoras embutidas na matriz circundante. O efeito da inibição da quinase RO sobre a força de tração é mostrado aqui. Os movimentos das partículas traçadoras são exibidos como uma imagem de projeção máxima de diferentes pontos de tempo, e cada ponto de tempo é colorido artificialmente.

Alternativamente, as imagens de uma partícula traçadora individual são exibidas em forma de colagem para mostrar o movimento da partícula traçadora. Com o tempo, essa partícula traçadora moveu-se em direção a e afastou-se da borda posterior da célula em migração antes e depois da adição de Y 2 7 6 3 2, respectivamente. A análise de FRAP acompanha células que expressam actina GFP enquanto migram em uma matriz tridimensional, indicando recuperação típica da fluorescência. Após um experimento de fotoablação em condições otimizadas de laser, a intensidade de fluorescência da região de interesse é visivelmente reduzida em comparação ao nível de fundo, mantendo-se as células saudáveis e não danificadas.

Este gráfico mostra o ajuste da curva de recuperação com uma função exponencial. Após dominar a técnica, semear as células na matriz pode levar uma hora. Não se esqueça de que trabalhar com três amino propil trimetil pode ser extremamente perigoso.

Portanto, tome precauções, como trabalhar na capela química. Lembre-se também de manter condições estéreis ao trabalhar com células em uma matriz tridimensional.