Em células vivas, imagens de células que expressam proteínas fluorescentes Migrando-marcado em uma matriz tridimensional

Processos celulares, tais como a migração das células têm sido tradicionalmente estudados em duas dimensões, superfícies de plástico duro. Este relatório descreve uma técnica para a visualização direta localização de proteínas e análise dinâmica de proteínas em células migrando de uma forma mais fisiologicamente relevantes, matriz tridimensional.

Esta demonstração tem como objetivo obter imagens de proteínas marcadas com fluorescência em células vivas em uma matriz 3D. Primeiro, gere linhagens celulares estáveis expressando proteínas marcadas com fluorescência. Semeie essas células em uma matriz de colágeno 3D e, em seguida, adquira imagens de lapso de tempo de células migratórias usando um microscópio confocal.

Em última análise, os resultados iluminam a localização e a dinâmica das proteínas dentro das células migratórias por meio de imagens de lapso de tempo e análise de FP, observando a dinâmica e a localização das proteínas em 3D e em tempo real. Oferece um caminho para abordar questões fundamentais na migração celular. Por exemplo, como os contatos adesivos são regulados por proteínas citoplasmáticas?

E também como esses contatos são perturbados por inibidores específicos. Em uma placa de cultura P 35, as células a 80 a 90% de fluência de co transfectam as células com o plasmídeo de interesse usando lipo 2000 de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, coloque as células em uma incubadora.

No dia seguinte, divida as células em duas placas de Petri P e 50 e incube durante a noite. Reabasteça o meio para adicionar 50 microgramas por mililitro de G quatro 18. Continuar a cultura sob seleção de antibióticos por duas semanas.

Examine a cultura para G quatro colônias resistentes a 18. Em seguida, usando um microscópio fluorescente invertido. Identifique e marque colônias positivas para GFP.

Lave as células duas vezes com PBS. Após a segunda lavagem, deixe uma fina camada de líquido para evitar que as células sequem para cada colônia marcada. Limpe o mais próximo possível da borda com um cotonete esterilizado e pipete 10 microlitros de tripsina na colônia.

Repita rapidamente para cada colônia. Em seguida, incube a placa a 37 graus centígrados para descolamento celular. Verifique a aparência redonda sob um microscópio.

Adicione 10 microlitros de tripsina em cada colônia, pipete para separar totalmente as células da placa. Em seguida, transfira cada colônia de células para um único poço de uma cultura de prato de 24 poços para amplificar colônias estáveis. Em seguida, avalie a expressão proteica das colônias usando western blot padrão e imunofluorescência.

Expanda as linhas celulares selecionadas modificação da superfície do vidro. O prato inferior proporciona uma ligação ideal ao colágeno. Pipetar 300 microlitros de solução de siloização na parte de vidro de cada placa P 35 com uma abertura de 10 milímetros.

Incube por uma hora em temperatura ambiente. Aspirar a solução e lavar com água filtrada três vezes durante 10 minutos cada. Retire a água e coloque a louça em uma placa quente de 50 graus centígrados por 1,5 horas.

Posicione a parte superior dos pratos ligeiramente fora do prato para permitir a secagem. Depois que os pratos secos esfriarem, pipete 300 microlitros de solução de glutaraldeído a 2% na parte de vidro de cada prato. Incube por uma hora e, em seguida, lave com PB S3 vezes por 10 minutos cada.

Proceda à esterilização dos pratos por exposição à luz ultravioleta por uma hora. Primeiro pellet 100 microlitros de partículas traçadoras fluorescentes por centrifugação. Descarte o líquido e ressuspenda as partículas em 500 microlitros de meio.

Execute cinco lavagens e, em seguida, ressuspenda as partículas em 30 microlitros de meio. Em seguida, colha as células que expressam GFP usando tripsina e prepare uma suspensão de 2 milhões de células por mililitro em um tubo einor Pipeta 240 microlitros de meio de crescimento. Adicione 12,6 microlitros de montes de um molar, 20 microlitros de água filtrada, 50 microlitros de solução celular e 10 microlitros de partículas fluorescentes.

Por último, adicione 167 microlitros de colágeno da derme bovina, uma solução de mistura completa da solução. Agora transfira 80 microlitros para a parte de vidro do prato siloizado preparado. Incube a 37 graus centígrados por 50 minutos para que o gel polimerize.

Em seguida, adicione cuidadosamente dois mililitros de meio de crescimento. Equilibre a câmara do microscópio a uma temperatura de estado estacionário de 37 graus centígrados para reabastecer o meio celular. Para manter um pH neutro para imagens DIC, troque a parte superior do prato por uma tampa de vidro com uma fina tira de paraforma.

Cubra a lateral do prato para evitar a evaporação para uma objetiva de imersão em óleo. Coloque uma gota de fluido de imersão na posição objetiva. O gel de colágeno contendo o prato no microscópio stage para que o prato entre em contato com o líquido de imersão.

Concentre a amostra e procure células de interesse para a imagem para minimizar o desvio do estágio. Deixe o prato repousar por cerca de 45 minutos. Antes de iniciar uma captura longa, especifique os parâmetros de aquisição de imagem para experimentos de adição de inibidor.

Prepare o meio suplementado com o medicamento em uma concentração de trabalho desejada. Reabasteça o meio celular para manter um pH neutro, mas não sele com perfil. Transfira a amostra para o microscópio e prossiga com a imagem no momento do tratamento medicamentoso.

Pause a imagem, capture e remova cuidadosamente a tampa do prato sem mexer no prato. Aspire o meio e pipete o medicamento contendo o meio para o prato. Em seguida, substitua cuidadosamente o prato.

A configuração do Top frap varia entre os sistemas. Portanto, consulte as instruções do fabricante. Primeiro defina parâmetros para imagens de células vivas.

Para fotobranqueamento. Teste esses parâmetros em células de prática para obter potência de laser suficiente para fotobranquear o sinal fluorescente sem danificar a célula. Em seguida, inicie a captura de imagem na amostra, adquirindo pelo menos cinco quadros.

Em seguida, fotobranqueie a região de interesse. Continue a capturar durante o tempo de recuperação. Meça a intensidade fluorescente média da área fotobranqueada antes e depois do fotobranqueamento ao longo do tempo, usando um software de análise estatística.

Ajuste a curva de recuperação à equação exponencial. Obtenha os parâmetros de intervalo e intensidade final da curva de ajuste exponencial. Em seguida, calcule a fração móvel tomando a razão entre as intensidades de fluorescência final e inicial.

Essas imagens 3D de células vivas mostram células epiteliais saudáveis expressando actina GFP. Após quatro dias de cultivo, essas células formaram um cisto em uma matriz de colágeno 3D. Algumas células migraram ao longo da superfície do cisto, enquanto outras migraram para o interior do cisto.

A deformação da matriz, como resultado das forças de tração exercidas pelas células migratórias, é analisada através do deslocamento de partículas traçadoras embutidas na matriz circundante. O efeito da inibição da RO quinase na força de tração é mostrado aqui. Os movimentos das partículas traçadoras são exibidos como uma imagem de projeção máxima de diferentes pontos de tempo e cada ponto de tempo é pseudocolorido.

Alternativamente, as imagens de uma partícula traçadora individual são exibidas como uma montagem para mostrar o movimento da partícula traçadora. Com o tempo, essa partícula traçadora se moveu em direção e para longe da borda de fuga da célula migratória antes e depois da adição de Y 2 7 6 3 2, respectivamente. A análise de frap segue as células que expressam actina GFP à medida que migram em uma matriz tridimensional, indicando recuperação de fluorescência típica Após um experimento de fotobranqueamento em configurações de laser otimizadas, a intensidade de fluorescência da região de interesse é visivelmente diminuída em comparação com o nível de fundo, mantendo as células saudáveis e não danificadas.

Este gráfico mostra o ajuste da curva de recuperação com uma função exponencial. Uma vez dominado, a semeadura das células na matriz pode levar uma hora. Não se esqueça de que trabalhar com três amino propiltrimetil pode ser extremamente perigoso.

Portanto, tome precauções como trabalhar na coifa química. Lembre-se também de manter condições estéreis ao trabalhar com células em uma matriz 3D.