Amida de hidrogênio / deutério Exchange & MALDI-TOF Análise Espectrometria de Massa de PAK2 Ativação

Este experimento demonstra como utilizar espectrometria de massa para monitorar a troca de deutério de hidrogênio associada à proteína. Mudanças estruturais que levam aos estados de ativação primeiro Cleve proteína quinase PAC dois com caspase três e, em seguida, ativar PAC dois por auto-fosforilação usando um TP como substrato como uma segunda etapa digerir PAC dois com Pepin e analisar o Prote PAC dois fragmentos por espectrometria de massa em tandem prosseguir para analisar padrões de troca de deutério de hidrogênio de PAC dois por molde fora monitoramento do nível de duração de cada PAC dois fragmentos o preciso nível de troca de hidrogênio deutério usando molde para análise. Forneça informações importantes sobre a clivagem da caspase três e a autofosforilação do PAC dois.

Este método pode ajudar a responder a perguntas sobre a dinâmica das proteínas, como alterações conformacionais de proteínas, interações de ligantes de proteínas e interações proteína-proteína. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a espectrometria de massa LCQ de troca HD, é instrumental. Este procedimento não requer uma espectrometria de massa ligada a HPLC para analisar os resultados da troca de HD, e o procedimento é fácil de operar para clivar 0,6 microgramas de PAC dois.

Adicione a caspase três e incube a reação a 34 graus Celsius por 30 minutos. Verifique o PAC dois e complete a clivagem do PAC dois pela análise de produtos por página SDS. Para a reação de ativação, adicione o pacote clivado de dois a 20 microlitros de tampão de ativação B e incube a 34 graus Celsius por 30 minutos.

Use a página SDS para confirmar a autofosforilação por migração dos fragmentos P 34 e P 27. Primeiro, lave as velocidades aro conjugadas com purina duas vezes com um mililitro de ácido tri-fluoroacético a 0,1% diluir dois microlitros de 10 miligramas por mililitro. Embale dois em 100 microlitros de 0,1% de TFA, adicione 30 microlitros de Pepsi lavada em contas agrícolas conjugadas e incube por cinco minutos.

Prossiga para equilibrar uma coluna H-P-L-C-C 18 de fase reversa com 0,1%TFA a pH 2,5. Agora carregue o Pepin Digest e dilua usando um gradiente linear de 100 minutos. Recolha as fracções de dois em dois minutos após a secagem das fracções de HPLC com um VAC reus de velocidade.

Suspenda as amostras em cinco microlitros de aceto nitrilo e 0,1% de TFA em pH 2,5. Como uma tela inicial. Analise cada fração para peptídeos por mofado para todas as frações contendo peptídeos.

Identifique os fragmentos por espectrometria de massa em tandem. Use a função do produto MS no prospector de proteínas para combinar os íons filhos e as razões MZ teóricas com base na sequência primária do PAC dois. Primeiro equilibre todas as soluções e reagentes para troca de deutério de hidrogênio.

Inicie a troca de deutério de hidrogênio adicionando 18 microlitros de tampão D, dois O a dois microlitros de 10 miligramas por mililitro. Pacote dois, execute reações em triplicado ao longo de um curso de tempo. Extinguir a reação de deutério de hidrogênio com 180 microlitros de 0,1% de TFA gelado a pH 2,2.

Agora distribua alíquotas de 100 microlitros de deutério de hidrogênio. Embale dois para cada 30 microlitros de grânulos agregados conjugados com pepina ativada. Incube esta digestão de pepina no gelo por cinco minutos.

O vórtice a cada 30 segundos encerra efetivamente as reações de digestão por centrifugação para remover o Pepin rapidamente. Congele as amostras em nitrogênio líquido para análise mofada. Prepare a matriz e armazene a zero graus Celsius, descongele parcialmente cada amostra rapidamente.

Misture um microlitro de amostra com um microlitro de matriz e, em seguida, coloque em uma placa-alvo mofada de quatro graus Celsius 30 segundos antes de mofar para análise. Aplique um vácuo moderado na placa para secar. As manchas continuam a adquirir espectros de massa mofados a massa média de 100 varreduras em dois minutos.

Prossiga para usar o programa de computador Data Explorer 4.0 para calcular a duração de cada fragmento. Em seguida, calcule a troca reversa com base na razão do real incorporado devido a um número em 24 horas de troca de deutério de hidrogênio dividido por todos os locais permutáveis possíveis, que são as amidas da espinha dorsal, exceto a amida terminal final. Neste exemplo, a clivagem e a autofosforilação do CASP Bay são verificadas pela coloração de Kumasi da página SDS.

O PAC inativo não fosforilado dois é uma banda única de 58 kilodaltons CASP bay's. A clivagem do PAC dois é completa e produz dois fragmentos, P 27, o domínio regulatório e P 34, o domínio catalítico após a autofosforilação. A migração de P 27 e P 34 autofosforilados mostra uma sobreposição no gel de proteína devido à migração retardada do fragmento de P 27 totalmente fosforilado em comparação com o pacote dois não fosforilado.

Este espectro de massa mostra um curso de tempo de incorporação de deutério para PAC dois inativo. O pico MZ 1697.85 é composto de vários picos isotópicos, conforme mostrado pelo deslocamento do envelope de massa. Com o tempo, a linha pontilhada vermelha indica a média do envelope de massa e o deslocamento do envelope de massa mostra a duração de um peptídeo uma vez dominado.

Essa técnica pode ser concluída em dois dias se for executada corretamente. Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio líquido pode ser extremamente perigoso, portanto, tome precauções como fazer um furo na tampa do tubo EOL de 1,5 mil antes de colocá-lo em nitrogênios líquidos.