Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

O objetivo geral deste procedimento é enxertar uma explicação do tubo neural dorsal de um embrião de codorna em um embrião de galinha compatível em estágios, de modo a rastrear a migração e o destino das células da crista neural. Isso é feito primeiro rasgando um pequeno orifício na membrana IGN do embrião de galinha hospedeiro para acessar o tubo neural. O embrião de codorna doadora é então removido de seu óvulo para prepará-lo para a excisão do enxerto.

Na próxima etapa, a região de interesse é excisada do tubo neural do embrião hospedeiro. Uma região semelhante é então excisada do tubo neural do doador para enxerto. Em seguida, o tubo neural do doador é transplantado para o tubo neural do hospedeiro.

Finalmente, o embrião quimérico é incubado até o estágio desejado para detecção de células da crista neural no órgão de escolha. Em última análise, a migração e diferenciação de células da crista neural derivadas do doador para vários locais no embrião hospedeiro podem ser visualizadas por meio de microscopia de imunofluorescência. A demonstração visual desse método é fundamental porque as etapas de microdissecção e enxerto exigem habilidades motoras muito finas, tornando-as difíceis de aprender.

Comece lavando todos os detritos dos ovos de pintinho com água morna. Disponha os ovos horizontalmente em uma bandeja e marque os lados voltados para cima com lápis para indicar a região onde o embrião será localizado. Para a preparação X ovo de embriões de doadores, incube as pernas de codorna com o lado rombudo.

Em seguida, coloque os ovos em uma incubadora umidificada a 38 graus Celsius e ative a função de balanço. Depois que os ovos terminarem, incube e esterilize os topos borrifando-os com etanol a 70% e, em seguida, limpe-os rapidamente com um lenço umedecido Para evitar qualquer absorção pelo ovo, coloque cada ovo esterilizado em um porta-ovos individual, semelhante à placa de Petri forrada com lenços umedecidos dobrados vistos aqui. Em seguida, usando uma pinça AA esterilizada, faça um pequeno orifício na superfície superior da casca do ovo na extremidade pontiaguda do ovo.

Equipe uma seringa de cinco mililitros com uma agulha hipodérmica de calibre 18 e meio. Em seguida, com o chanfro voltado para a extremidade pontiaguda do ovo, insira a agulha verticalmente no orifício da casca do ovo. Para evitar danificar acidentalmente a gema por sucção, limpe o orifício com etanol a 70% como antes e sele o orifício com fita adesiva.

Em seguida, com a pinça A dupla, faça outro orifício na superfície superior marcada da perna horizontal, não exatamente no ápice. Em seguida, insira um lado da pinça de íris curva no orifício paralelo ao ovo. Concha então beliscando a concha e trabalhando em movimentos circulares.

Quebre uma janela de dois centímetros de diâmetro no ovo de galinha, descarte a casca do ovo removida. O embrião deve aparecer como um disco opaco no topo da gema. Descarte todos os ovos não fertilizados identificados por uma pequena mancha branca na superfície da gema ou pela ausência da derme blaster.

Agora, enquanto estiver usando proteção adequada para os olhos, dobre uma agulha hipodérmica de calibre 26 e meio em um ângulo de 45 graus, começando na base da agulha. Depois de prender o lado chanfrado da agulha dobrada a uma seringa de um mililitro, encha a agulha com tinta nanquim diluída. Perfure a membrana vitelina fora do perímetro do blaster e deslize a ponta da agulha sob o embrião, perto da superfície da gema, mas não nas camadas embrionárias.

Em seguida, injete tinta apenas o suficiente para delinear o embrião e evitar injetar bolhas. Retire cuidadosamente a agulha. Agora usando um microscópio estéreo e uma fonte de luz com uma carga de calor limitada, como a lâmpada pescoço de ganso de fibra óptica mostrada aqui.

Estágio dos embriões de acordo com hambúrguer e Hamilton. Registre o estágio nas cascas dos ovos. Em seguida, aplique duas a três gotas de solução de ringer estéril quente na superfície dos embriões para evitar desidratação e contaminação.

Em seguida, estique o filme para sobre a superfície dos ovos para selar temporariamente as janelas. Em seguida, prepare os ovos de codorna para transplante. Antes de retirar os ovos da incubadora, encha uma placa de Petri com solução de ringer.

Em seguida, abra os ovos no lado cego com uma pinça curva para revelar o embrião. Usando uma tesoura de dissecação, faça quatro cortes em forma de quadrado através da membrana vili e do blaster derm fora do embrião, certificando-se de que todos os cortes se encontrem. Em seguida, usando uma pinça de íris curva, segure suavemente uma borda cortada e levante o embrião do ovo e transfira-o para a placa de Petri preparada.

Finalmente, remova suavemente a membrana vitelina com uma pinça número cinco e, em seguida, coloque os embriões sob um microscópio de dissecação. Remova o filme para do embrião de pintinho hospedeiro. Em seguida, usando uma agulha de tungstênio afiada, rasgue um pequeno orifício na membrana VII na região desejada do tubo neural.

Adicione uma gota de solução de ringer ao embrião. Em seguida, para enxertos unilaterais, como o que está sendo realizado neste vídeo, use uma agulha de vidro derramada para fazer cuidadosamente incisões transversais rostral e cordal na região do mesencéfalo do tubo neural, não se estendendo além do lúmen. Em seguida, corte bilateralmente entre o tubo neural dorsal e o mesoderma parial.

Finalmente, separe cuidadosamente o ex explan excisado do tubo neural e, em seguida, remova-o do embrião aspirando-o para uma micropipeta de vidro. Primeiro, use um embrião de codorna compatível com o estágio. Em seguida, excise uma região do tubo neural de tamanho semelhante à que acabamos de mostrar e aspire o explanador X do doador para uma micropipeta de vidro contendo solução de ringer.

Transfira a explicação X adjacente à região excisada do hospedeiro do pintinho. Em seguida, usando uma agulha de vidro puxada, oriente o ex explan, guiando-o suavemente para a região da ablação. Adicione cuidadosamente algumas gotas de solução de ringer ao embrião para evitar a desidratação.

Por fim, sele a janela com fita adesiva, certificando-se de que a fita veda toda a região do ovo com janela, retorne o ovo para a incubadora até o estágio desejado, desligando a função de balanço durante a incubação do kyira, o X pode ser girado suavemente com a mão duas vezes ao dia para aumentar sua viabilidade. Se os estágios posteriores de desenvolvimento forem direcionados, esta imagem representativa da região enxertada do tubo neural após seis horas de reincubação para HH 11 mostra a incorporação esperada do tecido doador de codorna enxertado no tubo neural do pintinho hospedeiro. Esta seção transversal através da região enxertada em HH 11 mostra células da crista neuro marcadas com hnk, uma migrando lateralmente para longe do tubo neural.

As células de codorna que contribuem para o fluxo migratório das células da crista neural e para o tubo neural são claramente marcadas com QCPN. Em estágios posteriores, as células derivadas de células da crista neural da codorna podem ser rastreadas até seu tecido-alvo final. Como pode ser visto nesta figura, as células marcadas com QCPN são intercaladas dentro do embrião de galinha meen chi do processo maxilar Em E cinco, o anticorpo QCPN pode ser facilmente combinado com outros anticorpos para examinar a diferenciação de células da crista neural derivadas de codornas.

No ambiente host. Como visto aqui, os neurônios sensoriais do trigêmeo derivados de células da crista neural de codorna são marcados por anticorpos QCPN e T UJ um. Após este procedimento, outros métodos, como imuno-histoquímica e hibridização in situ, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a quais tecidos as células da neurocrista dão origem e quais genes as células da neurocrista expressam à medida que se diferenciam em vários tecidos.