Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

O objetivo geral deste procedimento é enxertar um explante do tubo neural dorsal de um embrião de codorna em um embrião de galinha de estágio correspondente, com o fim de rastrear a migração e o destino das células da crista neural. Isso é realizado primeiramente rasgando um pequeno orifício na membrana IGN do embrião de galinha hospedeiro para acessar o tubo neural. Em seguida, o embrião doador de codorna é removido de seu ovo para ser preparado para a excisão do enxerto.

No próximo passo, a região de interesse é removida do tubo neural do embrião hospedeiro. Uma região semelhante é então removida do tubo neural do doador para o enxerto. Em seguida, o tubo neural do doador é transplantado para o tubo neural do hospedeiro.

Por fim, o embrião quimérico é incubado até o estágio desejado para detecção de células derivadas da crista neural no órgão de escolha. Em última instância, a migração e diferenciação de células da crista neural derivadas do doador para diversas localizações no embrião hospedeiro pode ser visualizada por meio de microscopia de imunofluorescência. A demonstração visual deste método é essencial porque as etapas de microdissecação e enxertia exigem habilidades motoras muito precisas, tornando-as difíceis de aprender.

Comece lavando qualquer resíduo dos ovos de pintinho com água morna. Disponha os ovos horizontalmente sobre uma bandeja e, em seguida, marque com lápis os lados voltados para cima, indicando a região onde o embrião estará localizado. Para o preparo X in ovo de embriões doadores, incube as pernas de codorna com o lado rombo para cima.

A seguir, coloque os ovos em uma incubadora umidificada a 38 graus Celsius e ligue a função de movimento oscilante. Após a conclusão da incubação, esterilize as partes superiores borrifando com etanol 70% e, em seguida, removendo rapidamente com um lenço de papel Kim. Para evitar qualquer absorção através da casca do ovo, coloque cada ovo esterilizado em um suporte individual para ovos, semelhante à placa de Petri forrada com lenços de papel Kim dobrados mostrada aqui. Em seguida, utilizando pinças AA esterilizadas, faça um pequeno orifício na superfície superior da casca do ovo na extremidade pontiaguda do ovo.

Equipe uma seringa de cinco mililitros com uma agulha hipodérmica de dezoito e meia polegadas de diâmetro. Em seguida, com a bisnaga voltada para a extremidade pontiaguda do ovo, insira a agulha verticalmente no orifício na casca do ovo. Para evitar danificar acidentalmente a gema por sucção, limpe o orifício com etanol 70% como antes e tampe o orifício com fita adesiva transparente.

Em seguida, com a pinça de duplo A, faça um furo adicional na superfície superior marcada da perna horizontal, não exatamente no ápice. A seguir, insira um dos lados da pinça de íris curva no furo, paralelamente ao ovo. Casca, então, pressionando a casca e movimentando em movimento circular.

Quebre uma janela, com dois centímetros de diâmetro, na casca do ovo de galinha, descartando a parte removida da casca do ovo. O embrião deve aparecer como um disco opaco sobre a gema. Descarte quaisquer ovos não fertilizados identificados por uma pequena mancha branca na superfície da gema ou pela ausência do blastoderma.

Agora, usando proteção ocular adequada, dobre uma agulha hipodérmica de calibre 26 e meio em um ângulo de 45 graus, começando pela base da agulha. Após fixar a agulha dobrada com a bisel voltada para cima em uma seringa de um mililitro, encha a agulha com tinta da Índia diluída. Fure a membrana do vitelo fora do perímetro do blaster e deslize a ponta da agulha sob o embrião, próximo à superfície do vitelo, mas sem penetrar nas camadas embrionárias.

Em seguida, injete apenas tinta suficiente para delinear o embrião, evitando a injeção de bolhas. Retire cuidadosamente a agulha. Agora, utilizando um microscópio estereoscópico e uma fonte de luz com carga térmica limitada, como a lâmpada de pescoço de ganso de fibra óptica mostrada aqui.

Estágie os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton. Registre o estágio nas cascas dos ovos. Em seguida, aplique duas a três gotas de solução de Ringer estéril morna sobre a superfície dos embriões para prevenir desidratação e contaminação.

Em seguida, estique uma película plástica sobre a superfície dos ovos para selar temporariamente as janelas. Depois, prepare os ovos de codorna para o transplante. Antes de retirar os ovos da incubadora, encha uma placa de Petri com solução de Ringer.

Em seguida, abra os ovos no lado rombo com pinça curva para revelar o embrião. Usando tesoura de dissecação, faça quatro cortes em forma de quadrado através da membrana de vilosidades e da ectoderme localizadas fora do embrião, certificando-se de que todos os cortes se encontrem. Em seguida, usando pinça curva de íris, segure suavemente uma das bordas cortadas e levante o embrião do ovo, transferindo-o para a placa de Petri preparada.

Por fim, remova cuidadosamente a membrana vitelina com pinça número cinco e, em seguida, determine o estágio dos embriões sob um microscópio estereoscópico. Remova o filme de parafina do embrião de galinha hospedeiro. Em seguida, utilizando uma agulha de tungstênio afiada, faça um pequeno orifício na membrana VII na região desejada do tubo neural.

Adicione uma gota de solução de Ringer ao embrião. Em seguida, para enxertos unilaterais, como o realizado neste vídeo, use uma agulha de vidro moldada para fazer cuidadosamente incisões transversais rostrais e caudais na região do mesencéfalo do tubo neural, sem ultrapassar a luz. Em seguida, corte bilateralmente entre o tubo neural dorsal e o mesoderma parietal.

Por fim, separe cuidadosamente o explante excisado do tubo neural e, em seguida, remova-o do embrião aspirando-o para dentro de uma micropipeta de vidro. Primeiro, utilize um embrião de codorna com estágio correspondente. Em seguida, excise uma região do tubo neural de tamanho semelhante à recém-mostrada e aspire o explante doador X para dentro de uma micropipeta de vidro contendo solução de Ringer.

Transfira o explante X para junto da região ressecada do hospedeiro galináceo. Em seguida, utilizando uma agulha de vidro puxada, oriente suavemente o explante, guiando-o para dentro da região ablada. Adicione cuidadosamente algumas gotas de solução de Ringer ao embrião para prevenir desidratação.

Por fim, feche a janela com fita adesiva, certificando-se de que a fita selou completamente toda a região do ovo com janela, e devolva o ovo ao incubador até o estágio desejado, desativando a função de balanço durante a incubação do kyira; o X pode ser suavemente girado à mão duas vezes ao dia para aumentar sua viabilidade. Se o objetivo forem estágios posteriores de desenvolvimento, esta imagem representativa da região enxertada do tubo neural após seis horas de re-incubação até o estágio HH 11 mostra a incorporação esperada do tecido doador de codorna no tubo neural do embrião de galinha. Esta seção transversal pela região enxertada no estágio HH 11 mostra células da crista neural marcadas com hnk, uma delas migrando lateralmente para longe do tubo neural.

Células de codorna que contribuem para o fluxo migratório das células da crista neural e para o tubo neural são claramente marcadas com QCPN. Em estágios posteriores, pode-se rastrear as células derivadas das células da crista neural de codorna até seu tecido-alvo final. Como pode ser visto nesta figura, as células marcadas com QCPN estão intercaladas dentro da mesênquima do embrião de galinha do processo maxilar. No estágio E5, o anticorpo QCPN pode facilmente ser combinado com outros anticorpos para examinar a diferenciação das células da crista neural derivadas de codorna.

No ambiente hospedeiro. Como visto aqui, neurônios sensoriais trigeminais derivados de células da crista neural de codorna são marcados pelos anticorpos QCPN e T UJ um. Após este procedimento, outros métodos como imunohistoquímica e hibridização in situ podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais tecidos as células da crista neural originam e quais genes as células da crista neural expressam enquanto se diferenciam em diversos tecidos.