Modelos MAME para formação de imagens 4D Live-célula do tumor: Interações microambiente que a progressão de Impacto maligno

O objetivo geral deste procedimento é construir modelos de co-cultivo tridimensionais denominados engenharia de arquitetura e microambiente mamários, ou MAM, para uso em imagem de células vivas de interações entre células em tempo real. Isso é realizado primeiramente revestindo lamínulas com colágeno tipo um D quenchado, ou colágeno DQ tipo um. Matriz de colágeno tipo um.

Em seguida, colágeno DQ inativado. Quatro. Matriz de membrana basal reconstituída é adicionada sobre o colágeno DQ solidificado, matriz de colágeno tipo I com fibroblastos incorporados. Na terceira etapa, uma suspensão de células epiteliais ou tumorais é sobreposta aos lamínulas, permitindo que as células adiram ao colágeno DQ, à matriz de membrana basal reconstituída quatro, e então o meio é adicionado.

Por fim, a microscopia confocal é utilizada para realizar a imagem em quatro dimensões (4D), que analisa uma imagem em três dimensões espaciais, além do tempo, em co-cultivos mamários vivos. Em última instância, a imagem 4D permite a visualização e análise da interação dinâmica entre células tumorais da mama e outras células do microambiente tumoral que podem influenciar a progressão para um fenótipo invasivo. Uma grande vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a imagem intravital, é que as interações observadas em nosso modelo ocorrem entre células de uma única espécie, ou seja, células tumorais humanas e células associadas ao tumor humanas, ao invés de, por exemplo, entre células tumorais humanas e células estromais de camundongo.

De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois a montagem dos cultivos principais exige, inicialmente, visualização e, em seguida, habilidades moderadas e prática para o sucesso. Comece colocando uma tampa retangular de plástico esterilizada com álcool. Insira-a em uma placa de cultura de 35 milímetros ou utilize um prato mu de 35 milímetros com IBI tree.

Em seguida, misture o número desejado de fibroblastos com colágeno DQ. Depois, utilizando uma micropipeta de 100 microlitros, pipete e espalhe cuidadosamente 70 microlitros da mistura de fibroblastos com colágeno DQ, uma matriz de colágeno tipo I, por toda a superfície do lamínula e coloque a placa de cultura em um incubador umidificado a 37 graus Celsius, sem dióxido de carbono, por 30 minutos. Após a solidificação das matrizes, deixe equilibrar por 10 minutos em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, coloque a placa sob uma capela até atingir a temperatura ambiente. Adicione 60 microlitros de colágeno DQ, quatro matriz de membrana basal reconstituída sobre o colágeno DQ solidificado, uma matriz de colágeno um com fibroblastos incorporados. Em seguida, usando a ponteira de uma pipeta, espalhe cuidadosamente o colágeno DQ quatro matriz de membrana basal reconstituída de forma uniforme, evitando arranhar os fibroblastos na matriz de colágeno DQ um, colágeno um.

Em seguida, transfira a placa e a lamínula para o incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 10 minutos, enquanto a matriz de membrana basal reconstituída de colágeno DQ está solidificando. Tripsinize os olhos e conte as células para o cultivo em co-cultura. Agora, coloque 50 microlitros da suspensão celular sobre a lamínula revestida e coloque a placa em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 40 a 60 minutos para permitir que as células adiram ao colágeno DQ. Quatro, reconstitua uma matriz de membrana basal; após as células terem aderido à matriz, adicione dois mililitros de meio de cultura contendo 2% de matriz de membrana basal reconstituída à placa de 35 milímetros.

Em seguida, incubar pelo período desejado antes da aquisição de imagens após lavagem com PBS; incubar as culturas em co-cultivo com cinco micromolar de cell tracker orange em meio MEGM em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 45 minutos. Após a incubação, lavar novamente as culturas em co-cultivo com PBS e incubar com meio MEGM pré-aquecido por 30 minutos em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Adquirir imagens das culturas em co-cultivo em baixa magnificação. Por exemplo, a 10 x com uma objetiva de imersão em água em um microscópio confocal, capturar seções ópticas em intervalos de 10 mícrons ao longo de toda a profundidade das estruturas.

Utilize as seções ópticas para reconstruir as imagens em 3D usando o software velocity ou um programa similar. Faça filmes dos reconstruções 3D para que as estruturas, as interações entre células e as interações com a matriz circundante possam ser visualizadas. Neste diagrama esquemático representativo de um co-cultivo de maim, um prato IBI treat mu foi primeiramente revestido com colágeno, um contendo colágeno DQ, um em fibroblastos como visto aqui em magenta.

Em seguida, foi adicionada uma segunda camada de membrana basal reconstituída contendo colágeno quatro DQ. Depois, células tumorais em vermelho foram semeadas sobre esta camada, com 2% de membrana basal reconstituída. Em cultura.

O meio representado pelos pontos de cor creme foi sobreposto a cada troca de meio. Os produtos fluorescentes de clivagem da colágeno DQ um e quatro são representados em verde. Ao longo dos 23 dias deste co-cultivo representativo de MCF 10 DCIS e WS 12 TI, houve proliferação das células observadas aqui e nas figuras seguintes, em vermelho, bem como degradação do colágeno DQ quatro e um observada aqui e nas figuras seguintes, em verde, e das matrizes de colágeno, indicada pela redução do volume dos co-cultivos.

As mesmas culturas vivas em co-cultivo foram observadas ao longo de 23 dias, com imagens capturadas por microscopia confocal nos dias três, 16 e 23 do co-cultivo. As interações nas co-culturas de Mame são dinâmicas e podem mudar ao longo do tempo. Por exemplo, como visto neste modelo 3D da co-cultura celular de mamífero no dia três, as células estão apenas começando a proliferar nas matrizes nesse momento, ainda bastante estáveis, como evidenciado pela ausência de fluorescência verde.

No entanto, no dia 16, enquanto as células continuaram a proliferar, também começaram a degradar a estrutura da matriz, conforme observado aqui pelos produtos de clivagem da colágeno DQ, um e quatro, em verde, e pela quebra ativa da matriz pelas células, onde a matriz e as células co-fluorescem, observado em amarelo. No dia 23, quase metade da matriz foi degradada pelas células em rápida proliferação, em comparação com o dia três, quando o volume da co-cultura era de 110.000 micrômetros cúbicos. Entre o dia 16 e 23, o volume foi reduzido para apenas 46.250 micrômetros cúbicos neste dia.

16 co-cultura, pode-se observar a proteólise do colágeno DQ quatro na superfície das células DCIS em vermelho e a proteólise difusa do colágeno DQ um em áreas próximas aos fibroblastos em branco. A coloração diferencial utilizada nesta co-cultura também permite a observação dos distintos padrões de migração e proliferação dos dois tipos celulares após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área do câncer de mama explorassem os efeitos do macroambiente tumoral na progressão do câncer, com imagens em tempo real das interações dinâmicas entre células cancerígenas e células estromais circundantes.