Preparação Individual Drosophila Ovos Câmaras de imagens ao vivo

O objetivo do seguinte experimento é registrar processos dinâmicos em locais U vivos de drosófila. Isso é conseguido primeiramente isolando ovários intactos de fêmeas bem alimentadas com dois dias de idade. Como segundo passo, folículos individuais são extraídos dos ovários para a obtenção de imagens das câmaras de ovos.

Em seguida, se expressarem uma proteína fluorescente apropriada, câmaras de ovos individuais podem ser diretamente analisadas por microscopia ou podem passar por manipulações adicionais, como microinjeção de marcadores fluorescentes antes da análise. Em última instância, por meio da análise das sequências de imagens em movimento, pode-se revelar a interação dinâmica de componentes intracelulares. Este método tem nos ajudado a responder algumas questões fundamentais no campo do transporte de RNA e da tradução localizada.

Por exemplo, como a expressão de proteínas que estabelecem o plano corporal é regulada no tempo e no espaço no embrião em desenvolvimento? Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois ele exige considerável rapidez e destreza. Com prática, resultados melhores serão obtidos.

A demonstração visual deste método é essencial, pois as manipulações das câmaras de ovo são difíceis de descrever por escrito e exigem experiência técnica e mãos firmes. Inicie este procedimento colocando uma pequena gota de óleo de halo carbono sobre uma lamínula e reserve-a. Em seguida, anestesie as moscas preparadas com dióxido de carbono.

Use uma pinça fina e afiada para segurar uma fêmea gorda pelo abdômen anterior. Não segure no centro do abdômen. Mantenha a fêmea aproximadamente dois a três centímetros acima do lamínula preparado.

Usando um segundo par de pinças, remova o tecido na extremidade posterior da fêmea. Isso geralmente incluirá tecidos do intestino com pinças limpas. Massageie suavemente o abdômen do extremo anterior ao posterior, como se estivesse espremendo pasta de dente de um tubo.

Os ovários parecem estruturas grandes e opacas e ficarão aderidos à extremidade da pinça. Colete os ovários tocando-os no óleo de carbono em halo na lâmina. Em seguida, repita o processo até que quatro a seis ovários sejam coletados.

Antes de isolar as estruturas aéreas, ajuste a fonte de luz do microscópio para que a iluminação incida sobre a lâmina em um ângulo raso e crie sombras contrastantes nos tecidos. Ao dissecar as moscas, é muito importante usar as ferramentas adequadas.

O ponteiro que usamos não é muito afiado para não danificar o tecido, mas suficientemente rombudo para podermos segurar a pinça que utilizamos. Novamente, não muito afiado para não danificar os tecidos, mas com ponta fina o suficiente para manipular os objetos sem entortar a ferramenta. Também é muito importante manter as ferramentas limpas, portanto as limpamos regularmente ao longo do procedimento com pinças fechadas.

Se pare os dois ovários removendo o tecido conectivo na extremidade posterior. A extremidade posterior possui as câmaras de ovos mais maduras. Oriente um ovário horizontalmente com as câmaras de ovos mais jovens voltadas para a sua mão dominante.

Em seguida, segure suavemente a extremidade posterior pelo tecido conjuntivo remanescente e use uma agulha de dissecação ou de tungstênio para separar individualmente os folículos ovarianos, desde o estágio Jamar até o estágio 10, que se separarão uns dos outros, mas os folículos mais velhos permanecerão ligados ao ovário. Com a agulha, arraste cuidadosamente de 15 a 25 folículos separados para o centro da gota de óleo. Se for necessário dissecar mais de um ovário, escolha um de outra mosca.

Descarte qualquer tecido ovariano em excesso e trabalhe rapidamente, pois os cítos começarão a exibir alterações fenotípicas devido ao estresse. Após 40 minutos de dissecção do ovário, remova o tecido ovariano em excesso do óleo. Usando instrumentos limpos para a injeção de cítos em estágio intermediário, oriente os aeróis perpendicularmente ao eixo longo do lamínula. Para isolar câmaras de ovos em estágio tardio.

Um método diferente é necessário para segurar a região posterior do ovário, conforme descrito anteriormente. Introduza a sonda de dissecação na extremidade posterior do ovário, próxima à pinça. Para evitar perfurar as câmaras de ovos, insira a sonda entre as câmaras de ovos em estágios tardios.

Puxe a agulha de dissecação através do ovário até que ela saia nos folículos em estágio inicial. Quando realizado corretamente, a sonda removerá o tecido conjuntivo que mantém os aerólios e os folículos em estágio avançado em posição. Repita este passo até que os aerólios estejam espalhados sobre a lamínula.

Quando as câmaras de ovo não estiverem mais empilhadas umas sobre as outras, esta etapa estará concluída. Usando uma sonda de dissecação, separe as câmaras de ovo em estágios avançados para facilitar a obtenção de imagens e posicionar o Estágio 14. Use pinças para segurar as apêndices dorsais das câmaras do pescoço.

Prepare as soluções a serem injetadas por meio de uma breve centrifugação em alta velocidade. Isso irá pelotizar quaisquer depósitos sólidos que possam obstruir a agulha de injeção. Em seguida, carregue a agulha de injeção com uma ponteira de carga e fixe cuidadosamente a agulha carregada ao injetor.

Agora, coloque um pequeno pedaço de vidro adjacente às amostras e monte a lâmina na platina do microscópio. O vidro servirá como uma parede para quebrar ou desfazer. Desligue a agulha.

Prepare o microscópio e o aparelho de injeção para o experimento. Tendo o cuidado de não quebrar a ponta da agulha. Se possível, utilize uma platina automatizada com capacidade de visita a pontos para marcar todos os cistos do estágio oito e do estágio nove para injeção.

Agora, abaixe a agulha de injeção até que toque o óleo. Selecione o primeiro ponto na lista de pontos marcados e foque no citoplasma. Abaixe manualmente a agulha até que ela esteja no mesmo plano de foco do citoplasma.

Usando os controles do manipulador, mova a ponta da agulha de injeção até que ela esteja dentro do sítio U. Um movimento rápido de perfuração geralmente é mais eficaz do que um movimento lento. Uma vez no interior, ejetar um pequeno volume pela agulha e avaliar visualmente os efeitos.

A repetição é necessária. Se a injeção for bem-sucedida, o citoplasma no interior do citócito será deslocado. A quantidade exata de fluido injetado é difícil de quantificar.

Para aumentar o volume injetado, ajuste a pressão ou a duração do pulso de injeção. Quebre a ponta da agulha para aumentar ligeiramente sua abertura, ou simplesmente utilize múltiplos pulsos de injeção antes de selecionar a próxima célula. Levante a agulha de injeção o suficiente no óleo para que ela não colida com outras células.

Perfurar extensivamente ou permanecer com a agulha dentro da célula danifica gravemente a câmara do óvulo. Portanto, seja rápido. A injeção deve levar menos de 10 segundos.

Se um erro for cometido, passe para a próxima marca em um local. Não perca tempo com danos à visão. Quando a agulha entupir, mova a agulha para o pedaço quebrado de vidro.

Com o vidro e a agulha no mesmo plano focal, empurre suavemente a agulha contra o vidro. Verifique se a agulha está desobstruída pressionando o botão de injeção e observando se algum fluido sai da ponta da agulha. Quando todos os locais de injeção nos Estados Unidos tiverem sido injetados, mova manualmente a agulha para fora do óleo e posicione-a fora do trajeto do feixe do microscópio.

Certifique-se de que está em uma orientação segura para evitar danos oculares e que as luzes estão apagadas. Para facilitar a velocidade da imagem de fluorescência, isso é essencial. Se transcorreu uma hora ou mais entre o isolamento da câmara de ovócitos e a injeção nos citos, os citos serão difíceis de injetar e exibirão alterações fenotípicas associadas ao estresse.

Problemas semelhantes podem surgir com o manuseio brusco do citóforo ou com a injeção de volumes excessivos. Câmaras de ovos que expressam proteínas fluorescentes transgênicas podem ser visualizadas sem necessidade de injeção. A marcação por MS2 de RNA endógeno pode ser visualizada com bons resultados utilizando os procedimentos de isolamento de tecidos com o procedimento completo sintetizado in vitro.

A RNA Alexa 546 foi injetada em uma câmara de oócito ME31B-GFP, localizando-se no polo anterior dorsal do oócito e formando um capuz ao redor do núcleo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de 10 minutos, desde o início da dissecação até o início da aquisição de imagens. Ao tentar este procedimento, cuide do tecido trabalhando rapidamente, mas com cuidado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como registrar processos dinâmicos em oócitos vivos de Drosophila.