Name: Hibridização In situ Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a realizar hibridização in situ em glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores para visualizar padrões de expressão gênica. Este método permite localizar transcritos específicos e compreender a regulação da expressão gênica em processos biológicos.

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Os autores gostariam de agradecer a Marika Walters para o conselho de hibridização desenvolvimento de métodos in situ de tecidos moles e Goltsev Yury para discussão de protocolos para a hibridização in situ de embriões Anopheles gambiae, que foram posteriormente adaptados e modificados para desenvolver o protocolo descrito aqui para hibridização in situ de Aedes e Culex embriões. Reconhecemos também recomendações úteis dadas por Adam Paré e Kosman David. Agradecemos Osvaldo Marinotti para a discussão científica e editar o texto do protocolo.

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</ol>

Os autores não têm divulgações.

A hibridização in situ protocolo de coloração e colorimétricas apresentadas aqui para tecidos toda montagem de mosquitos e de embriões é uma técnica útil para a localização de transcritos dentro dos órgãos e tipos específicos de células. Esses procedimentos são um avanço em relação nossos métodos reportados anteriormente, tanto na racionalização etapas de lavagem e proporcionando amplos detalhes técnicos adicionais e fontes de reagentes. Na nossa experiência, a detecção colorimétrica de sinais de hibridação é superior em sensibilidade e clareza de sinal de hibridação em comparação com os regimes de fluorescência de detecção baseados em. Além disso detecção colorimétrica contorna problemas associados com a discriminação do sinal em embriões, que são inerentemente auto-fluorescente. Limitações na detecção de sinais de hibridação ocorrer, quando baixa abundância transcrições são alvejados e coloração de fundo é evidente. O aumento da temperatura de hibridação a 65 ° C, foi encontrada a reduzir para trássolo sinais de hibridação, mas não é um substituto sugerido para a concepção de sondas único alvo-específicas de RNA. Este protocolo tem sido usado para realizar a hibridação in situ de toda montagem glândulas salivares de Aedes aegypti, e os ovários e embriões de Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus. Este método também é aplicável a outros tecidos de mosquito, e presumivelmente aqueles de outros insectos. Além disso, nós compilamos para as diretrizes da primeira vez comparativas para a realização do desenvolvimento embrionário em três mosquitos vetores, Ae. aegypti, An. gambiae e Cx. fatigans. Observações foram relatadas para as estirpes específicas destas três espécies, em condições de criação discretos. É importante notar que o curso de tempo de desenvolvimento podem variar para diferentes estirpes de espécies de mosquitos e sob condições de criação diferentes. Hibridizações em suplemento situ em curso esforços para analisar as transcriptomas de mosquitos e outros artrópodes, e pode fornecer uma melhor imagem da regulação da expressão genética nestes organismos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrífuga de 1,5 ml tubos </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Menos opaco do que os tubos padrão; auxilia na visualização de amostras </td></tr><tr><td> Formamida deionizada </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Água DEPC </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> O hipoclorito de sódio 5,25% </td><td> Austin </td><td></td><td> A-1 Marca </td></tr><tr><td> RNA polimerase T3 Plus- </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> O armazenamento a -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 RNA Polimerase </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> O armazenamento a -20 ° C </td></tr><tr><td> Etanol a 95% </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand pipetas de transferência de polietileno descartáveis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeído a 37% </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tampa de vidro de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 milímetros </td></tr><tr><td> N-Heptano </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xileno </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex Placa Ponto 9-bem </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 milímetros </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> De hidróxido de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost / Plus lâminas de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 milímetros </td></tr><tr><td> Davlyn Red fita Toupee-liner Limpar </td><td> Cabelo Direto </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / material Pele base de 0,75 em x rolo de fita 12 m </td></tr><tr><td> TOPOTA Kit clonagem para Sequening com um tiro Top10 quimicamente competente E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reacções 40 reações </td></tr><tr><td> ADN de esperma de salmão sonicado </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> O armazenamento a -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina-AP fragmentos Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA rotulagem mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> O armazenamento a -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP de solução stock </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Reagente de bloqueio Ocidental </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech malha de poliéster (330,130) </td><td> Saati impressão </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 fios / cm, 34 micron diâmetro de rosca, cor de laranja </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% em PBT </td></tr><tr><td> Sal de sódio da heparina </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeído a 37% </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> Alíquotas de 10 ml em ampolas âmbar </td></tr><tr><td> 16 onças Individuais recipientes de papel com tampas </td><td> O Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro borosilicato scintillatfrasco de íons com tampa de rosca solta </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml de 500 caso </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubble Wrap material de enchimento celluar </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 pés / roll 0,188 polegadas de espessura </td></tr><tr><td> Frango soro </td><td></td><td></td><td> O sangue total foi recolhido quer a partir da veia da asa ou por punção cardíaca a partir de uma galinha juvenil. O sangue foi incubada a 37 ° C durante 1 h até coagulado e depois colocado em gelo durante 30 min. O soro foi recolhido e centrifugado a 3000 xg durante 10 min. O sobrenadante resultante (clarificado soro) foi recolhido e armazenado a -20 ° C até à utilização. </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Tabela de reagentes específicos e equipamento para a hibridação in situ.

hibridização<em&gt; in situ</em&gt; das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Os mosquitos são vetores para um conjunto diverso de patógenos, incluindo arbovírus, protozoários e nematóides. Investigação de transcrições e reguladores de genes que são expressos em tecidos em que o mosquito hospedeiro e interagir patógeno, e de órgãos envolvidos na reprodução são de grande interesse para as estratégias para reduzir o mosquito-borne transmissão da doença e impedir o desenvolvimento do ovo. Um certo número de ferramentas foram utilizados para estudar e validar a regulação temporal e tecido específico da expressão do gene. Aqui, nós descrevemos protocolos que têm sido desenvolvidos para obter informação espacial, que aumenta a nossa compreensão de onde genes específicos são expressos e os seus produtos acumular. O protocolo descrito foi utilizado para validar expressão e determinar os padrões de acumulação de transcritos em tecidos relacionados com transmitida por mosquitos transmissão de patógenos, tais como do sexo feminino glândulas salivares, bem como compartimentos subcelulares de ovários e embriões, que retarde para reprodução do mosquito e desenvolvimento. Os procedimentos seguintes representam uma metodologia optimizado que melhora a eficiência de vários passos do protocolo sem perda de sinais de alvo específicas de hibridação. Diretrizes para a preparação do RNA sonda, a dissecção dos tecidos moles e ao procedimento geral para a fixação e hibridação estão descritos na Parte A, enquanto os passos específicos para a coleta, fixação, hibridação e pré-hibridação de embriões de mosquitos são detalhados na Parte B.

Análises de expressão temporal e espacial de genes têm um papel crucial em genômica funcional. Todo mount-hibridização<em&gt; In situ</em&gt; É útil para determinar a localização de transcritos nos tecidos e compartimentos subcelulares. Aqui nós esboçamos uma hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo com modificações para tecidos-alvo específicos em mosquitos.

Hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores

Os mosquitos são vetores de um conjunto diversificado de patógenos, incluindo arbovírus, parasitas protozoários e nematódeos. A investigação de transcritos e genes...

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar hibridização em C dois para determinar os padrões de localização e acúmulo de transcritos específicos nos tecidos e embriões de mosquitos. Isso é alcançado primeiramente fixando os tecidos ou embriões de mosquito, de modo que a ultraestrutura do tecido e os alvos de mRNA sejam preservados e fiquem disponíveis para hibridização com sondas de RNA antissenso. Em seguida, as sondas de RNA antissenso são hibridizadas aos transcritos-alvo nos tecidos ou embriões fixados.Em seguida, são realizados métodos de coloração com anticorpos para cólera a fim de detectar padrões de localização e acúmulo de mRNA-alvo. São obtidos resultados que mostram padrões espaciais de acúmulo de RNA com base na hibridização em C dois e métodos de detecção colorimétrica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da genômica funcional, como determinar quando e onde os produtos gênicos se acumulam no mosquito.Este procedimento também nos permite obter informações sobre localização espacial para compreender melhor como a expressão gênica é regulada em processos biológicos como o desenvolvimento reprodutivo e as interações entre o mosquito e patógenos. Para preparar a hibridização de sondas de RNA marcadas com digoxigenina em tecidos de mosquito, comece dissecando os ovários e as glândulas salivares. Em seguida, fixe o tecido e trate com proteinase K, se necessário.Após o pós-fixação dos tecidos, equilibre-os em um mililitro de uma mistura um para um de solução de hibridização PBT ou HIB PBT por 30 minutos com mutação, aguarde a sedimentação do tecido e, em seguida, decante o máximo possível de HI PBT. Em seguida, adicione um mililitro de HIB em cada tubo de amostra. Envolva o tubo de amostra em embalagem protetora selada contra o ar, como papel bolha, e coloque-o dentro de um frasco de hibridização.Selar o frasco com uma tampa de frasco de hibridização e incubar a 55 graus Celsius por 30 minutos com rotação. Após retirar o frasco do incubador e permitir que o tecido sedimente, decantar cuidadosamente o tampão de pré-hibridização, deixando 50 microlitros de solução no tubo para evitar perda da amostra. Em seguida, adicionar 50 microlitros do tampão alto pré-aquecido à mesma amostra e colocá-la em um bloco térmico ajustado a 55 graus Celsius; desnaturar a sonda de RNA previamente preparada a 85 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, coloque imediatamente no gelo por cinco minutos. Depois, pipete o sonda de RNA no tubo da amostra. A sonda de RNA flutuará na superfície da solução HI.Agite o tubo levemente. Incube suavemente as amostras em um suporte fixo para microcentrífuga dentro de uma estufa de hibridização a 55 graus Celsius por 16 a 24 horas. Após o tratamento com RNAs e coloração com anticorpo, conforme descrito no protocolo escrito.Monte as amostras de tecido utilizando primeiro uma ponteira de pipeta de 200 microlitros para transferi-las para poços individuais de fundo redondo em uma placa de vidro Pyrex. Remova o máximo possível do PBT e cubra a amostra com glicerol 70% em água. Deixe o glicerol penetrar na amostra a quatro graus Celsius durante a noite.Para preparar lâminas de microscópio, comece limpando a superfície da lâmina com lenços Kim. Em seguida, aplique duas tiras de fita adesiva invisível paralelamente uma à outra, de modo que formem um canal estreito, utilizando um pincel de artista. Colete as amostras uma a uma e coloque-as ao longo do comprimento do canal, posicionando cada amostra com a mesma orientação em relação aos alinhamentos anterior, posterior e dorsal-ventral.Após posicionar cada amostra, utilize um cotonete de lenço de papel Kim para absorver a solução excedente de glicerol ao redor dos tecidos. A remoção do glicerol em excesso é importante para evitar a formação de bolhas ao selar as amostras montadas sobre a lâmina sob uma lamínula; cuidadosamente, coloque uma lamínula sobre o canal contendo as amostras alinhadas. Usando esmalte de unha transparente, fixe a lamínula de forma semipermanente sobre a lâmina aplicando-o nas pontas. Usando uma pipeta de 200 microlitros, dispense lentamente 70% de glicerol em uma das extremidades do canal para preencher completamente o canal e a área sob a lamínula.Selar as amostras montadas aplicando esmalte ao longo dos quatro lados da lamínula. Deixar o esmalte secar completamente antes de realizar a imagem das amostras. Após coletar embriões de uma gaiola com 300 fêmeas adultas acasaladas de mosquitos e permitir que se desenvolvam até os estágios desejados, transferi-los do recipiente de coleta para um tubo de captura com malha de tylene para embriões de oitenta.Coloque o tubo coletor em um béquer preenchido com água destilada suficiente para que o volume do tubo coletor fique pela metade. Use um pincel de artista para desprender os embriões da malha de tylene e transferi-los para o tubo coletor cheio de água. Para embriões difíceis de remover, desprenda a malha de tylene do recipiente de coleta e dobre cuidadosamente a malha para formar um funil, segurando esse funil com uma das mãos.Use a outra mão para borrifar água ao longo das laterais do funil, lavando os embriões para o tubo coletor. Este método pode ser aplicado a embriões anômalos, pois eles não possuem a substância adesiva presente na superfície de embriões oitenta, que permite que os ovos adiram a substratos em posição superior. Prepare 40 mililitros de solução de decoração e despeje a solução em uma placa de Petri de 100 milímetros.Adicione 50 mililitros de água destilada a um béquer de 100 mililitros e reserve. Em seguida, coloque os embriões na placa de Petri contendo a solução de decoração. Utilize uma pipeta descartável de polietileno para lavar os embriões, girando o tubo de recolha de modo que os embriões permaneçam submersos e agitados na solução de decoração.A desseda é uma das etapas mais sensíveis do protocolo, e a prolongação excessiva do tratamento com hipoclorito de sódio em embriões oitenta impedirá a adequada formação do endocório. É necessário um tempo máximo de 35 segundos para dessedar embriões oitenta, enquanto 75 segundos são suficientes para embriões QX. Sob um microscópio estereoscópico com baixa ampliação, verifique a desseda. Os embriões oitenta não apresentarão o exocório com aspecto de rede e somente a superfície lisa e polida do endocório escuro estará presente; já nos embriões anômalos, o exocório permanece.As estruturas flutuantes e as cristas exocoriônicas estarão ausentes assim que os embriões forem revestidos. Prossiga para fixar e romper o endocorião de acordo com o procedimento descrito no protocolo escrito. Para remover o endocorião rompido, coloque um pedaço de fita adesiva dupla face para peruca no centro de uma placa de Petri de três centímetros usando uma ponteira de pipeta de 200 microlitros de grande orifício.Transfira os embriões do metanol para a fita adesiva dupla face. Aguarde um a dois minutos para que os embriões assentem e adiram à superfície da fita, decante o metanol em excesso e deixe a superfície secar levemente por um a dois minutos. Em seguida, adicione etanol 95% na placa de Petri para imobilizar ainda mais os embriões na fita; pipete 600 microlitros de água destilada no etanol e agite suavemente para misturar.Em seguida, utilize uma agulha 27,5 acoplada a uma seringa de um mililitro para remover o córion interno rachado. Após liberar o embrião branco dos resíduos do córion interno escuro usando um pincel de ponta fina, transfira imediatamente os embriões do adesivo para o reservatório de etanol da placa de Petri. Em seguida, utilizando uma ponteira de três milímetros ou pipeta, transfira os embriões para um tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de etanol a 100%. Por fim, lave os embriões duas a três vezes em etanol a 100% e armazene os embriões em etanol absolutamente puro a menos 20 graus Celsius.Nesta figura em C, a hibridização de glândulas salivares inteiras de fêmeas de Aedes aegypti com sondas de mRNA que visam amilase 1D, sete S dois e D sete L dois mostra o acúmulo desses transcritos nos lóbulos lateral proximal, lateral distal e medial lateral distal, respectivamente. Neste experimento, Cytos inteiros de três espécies de mosquitos foram hibridizados com sondas de mRNA que visam especificamente os transcritos autólogos respectivos de Oscar. Aqui, em C dois, foi realizada a hibridização de embriões inteiros de Anopheles gambiae, Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus utilizando sondas de RNA antissenso que visam os transcritos autólogos de Oscar nos respectivos mosquitos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de hibridização in loco em Culex para determinar a localização e o acúmulo de transcritos em tecidos específicos de mosquitos ou em embriões.

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Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

Nós descrevemos um método para processar e tela de campo coletados mosquitos para uma diversidade de vírus por cultura de células Vero ensaio. Empregando esta técnica, temos detectados nove tipos diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas em mosquitos coletados em Connecticut.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Aprenda a realizar hibridização in situ em glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores para visualizar padrões de expressão gênica. Este método permite localizar transcritos específicos e compreender a regulação da expressão gênica em processos biológicos.

Hibridização

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