A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma janela estável no crânio fino sobre o córtex do camundongo, permitindo imagens repetidas sem a perturbação do ambiente intracraniano. Isso é realizado primeiramente fixando um suporte para a cabeça, que permitirá mantê-la de forma estável sob o aparelho de imagem. Em seguida, afina-se cuidadosamente o crânio em uma região sobre a superfície dorsal do cérebro e poli-se a superfície com abrasivo fino.

Em seguida, cubra a janela com uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato e um lamínula para reforçar a janela. O passo final é preparar o animal para a aquisição de imagens no microscópio de dois fótons. Em última análise, in vivo, a microscopia de dois fótons é utilizada para mostrar estruturas finas, como artérias, veias capilares e dendritos neuronais, que podem ser imagiadas até 250 micrômetros de profundidade no córtex ao longo de semanas.

A principal vantagem dessa técnica de janela craniana é que o crânio sobrejacente ao córtex permanece intacto. Primeiro, afinamos o crânio para obter clareza óptica e, em seguida, reforçamos o crânio com cola de cianoacrilato e a lamínula. Este método deve ser útil para estudar uma diversidade de camundongos transgênicos fluorescentes nos estados anestesiados ou de OIC.

Para iniciar este procedimento, autoclave os instrumentos cirúrgicos necessários e anestesie um camundongo com cerca de três a seis semanas de idade, conforme os métodos descritos no manuscrito acompanhante. Verifique o reflexo por meio de pinçamento dos dedos dos pés para garantir que o camundongo esteja no plano cirúrgico de anestesia. Em seguida, fixe o camundongo em um estereotáxico.

Mantenha a temperatura corporal do camundongo a 37 graus Celsius. Utilize uma sonda retal com regulagem por feedback e uma manta térmica. Aplique pomada oftálmica nos olhos para manter a umidade.

Em seguida, raspe o couro cabeludo com a lâmina elétrica pequena. Depois disso, limpe o couro cabeludo com Betadine, seguido por aplicação com álcool isopropílico a 70%. Então, aqueça uma alíquota de fluido espinhal cerebral artificial estéril a 37 graus Celsius sob um microscópio.

Remova o couro cabeludo em toda a superfície dorsal do crânio com um par de tesouras cirúrgicas. Corte a pele lateralmente até as bordas dos músculos temporais em ambos os lados do crânio e posteriormente aos músculos do pescoço. Em seguida, use uma lâmina de bisturi para remover o fino periósteo da superfície do crânio.

Em seguida, seque e limpe o crânio. Depois disso, aplique uma camada fina de cola de cianoacrilato na superfície do crânio. Deixe a cola secar completamente.

Essa camada de cola é necessária para a aderência adequada do cimento dental. Em etapas subsequentes. Para a preparação de imagem em animais acordados, faça furos e introduza dois parafusos autoatarraxantes número 0 0 0 na superfície óssea contralateral.

Em seguida, fixe um conector rígido personalizado com dois pontos de fixação ao crânio. Isso reduz significativamente os graus de liberdade e simplifica a realocação do mesmo campo de imagem em estudos longitudinais. Uma barra transversal larga também oferece amplo espaço para a colocação de eletrodos e estimulação da vibração.

Em seguida, cubra toda a superfície do crânio, exceto a localização da janela, com uma camada de cimento dental, garantindo que todas as bordas expostas da pele sejam cobertas pelo cimento. Antes de afinar o crânio, certifique-se de que as brocas estejam afiadas e evite reutilizá-las. Use uma broca dentária em baixa velocidade para afinar uma região de dois milímetros por dois milímetros sobre o córtex somatossensorial com uma broca de meio milímetro.

Em seguida, adelgaçar a superfície óssea seca por apenas alguns segundos de cada vez, utilizando o crânio com LCR periodicamente para evitar aquecimento. Depois, adelgaçar o osso. Alternar então para uma velocidade mais lenta da broca e raspar a superfície do crânio com toques leves.

A broca deve se aproximar da superfície em um ângulo de aproximadamente 30 graus em relação à vertical. Continue afinando o osso além da camada vascular, até a segunda camada óssea, acima da superfície do cérebro.

Mantenha a broca com movimentos pequenos e controlados, aplicando força apenas na direção lateral. Quando o osso tiver cerca de 50 micrômetros de espessura, os vasos da lâmina deverão ser claramente visíveis através do osso úmido. Nessa profundidade, pequenos pontos brancos dentro do osso se tornarão visíveis por alguns segundos.

Imediatamente após a superfície seca do crânio ser umedecida, a espessura final do osso deve ser de cerca de 10 a 15 micrômetros. Quando o osso estiver suficientemente fino, os pequenos pontos brancos no osso não serão mais visíveis ao umedecer a superfície seca do crânio. Agora, pola a janela com pó de óxido de estanho.

Use um pequeno punhado de pó, aproximadamente um quarto do tamanho da janela, agite uma suspensão de pó com um LCR usando uma broca pré-fabricada com ponta de silicone. Polir a superfície por 10 minutos, remover completamente o pó de óxido de estanho da janela e secar o osso. Esse processo deve ajudar a reduzir quaisquer bordas irregulares deixadas pela broca durante o procedimento de adelgaçamento.

Em seguida, corte alguns quadrados de lamínula número zero com tamanho ligeiramente menor que o da janela. Use um estilete para marcar suavemente linhas horizontais e verticais separadas na lamínula. Deslize com uma borda reta sem quebrar o vidro.

Em seguida, coloque a lamínula em uma placa de Petri. Separe os pedaços de vidro batendo a placa contra a borda de uma mesa. Depois, aplique um pequeno ponto de cola Sano ACRL sobre a janela usando a ponta de madeira de um aplicador descartável com ponta de algodão quebrado.

Coloque rapidamente um pedaço pré-cortado de lamínula sobre a cola. Evite formar bolhas sob a lamínula após a cola ter secado completamente por 15 minutos. Remova o excesso de cola de cianoacrilato da superfície superior da lamínula com uma lâmina de bisturi.

Selar as bordas da janela com cimento dental. Em seguida, formar um reservatório levemente elevado para conter água para a lente de imersão na extremidade. Colocar o animal em uma gaiola aquecida até que se recupere completamente da anestesia.

Neste passo, estabilize o animal em uma placa óptica para imageamento e use o suporte como apoio para a cabeça. Nossa placa separada pode transportar o animal e todos os dispositivos de monitoramento fisiológico montados como uma única unidade entre os locais cirúrgico e de imageamento com dois fótons. Se o imageamento do fluxo sanguíneo for desejado, injete 0,05 mililitros de corante de dextrana fluorescente a 5% pela veia infraorbital para marcar o soro sanguíneo.

Isso deve ser feito sob anestesia geral e o corante geralmente permanece na circulação por várias horas. Injete solução de Ringer lactato por via intraperitoneal em um volume de três microlitros por grama a cada duas horas para manter os fluidos corporais e as necessidades energéticas. Desperte o camundongo interrompendo a isoflurano.

Uma hora após o despertar, o camundongo está pronto para a aquisição de imagens. Feche a gaiola sobre o microscópio para evitar contaminação pela luz. Abaixo, mostra-se um exemplo da vasculatura cortical de uma coxa, de um camundongo YFP marcado por injeção intravenosa de dextrana conjugada com Texas red. Vasos durais são frequentemente visíveis ligeiramente acima da superfície cortical na dura-máter.

As artérias da camada e as veias estão localizadas na superfície cortical. Vasos penetrantes ramificam-se a partir dessa rede superficial e mergulham no córtex, onde se ramificam em uma densa rede capilar que nutre o tecido cortical. Este filme mostra a vasculatura na superfície da camada em um camundongo acordado.

Podem ser observadas oscilações espontâneas no diâmetro arterial quando o animal está em um estado de repouso tranquilo. Este método deve ser útil para estudar uma ampla variedade de animais transgênicos fluorescentes, tanto no estado anestesiado quanto acordado.