Cromatina imunoprecipitação (CHIP), utilizando Drosophila Tecido

Este procedimento gera dados de imunoprecipitação da cromatina a partir de tecido de drosófila dissecado para refletir com precisão o estado da cromatina em tecido de drosófila in vivo. Neste caso, centenas de testículos são coletados por dissecção manual. Ensaios de imunoprecipitação da cromatina são realizados utilizando um anticorpo contra a proteína de interesse.

Realize um ensaio de análise quantitativa por R-T-P-C-R para enriquecimento da região genômica específica no DNA cromatina imunoprecipitado purificado. Alternativamente, o sequenciamento de alto rendimento da amostra de chip gera um perfil em todo o genoma. Em última instância, a análise de chip de tecido dissecado fornece uma representação do estado da cromatina em células nas suas condições fisiológicas.

Este protocolo é otimizado para a análise de tecidos isolados diretamente do organismo. Para obter estados da cromatina e informações epigenéticas sob condições fisiológicas reais, demonstraremos o uso de chip em *Drosophila* para analisar o estado da cromatina. Este protocolo pode ser aplicado a outros organismos, como camundongo ou peixe-zebra.

A demonstração visual deste protocolo é essencial para obter DNA de qualidade e quantidade insuficientes para utilização em chips ou na geração de bibliotecas de sequenciamento para sequenciamento de alto rendimento. Primeiro, dissecar o tecido de interesse, neste caso cerca de 200 pares de testículos de drosófila, em PBS frio contendo inibidor de protease e PMSF a 100 microgramas por mililitro. Após lavar o tecido duas vezes, ressuspender em 200 microlitros da mesma solução de PBS com inibidores.

Em seguida, fixe a amostra com 5,5 microlitros de formaldeído aquecido a 37%. Incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Vortexe a cada cinco minutos e deixe o tecido sedimentar no gelo.

Lave duas vezes com 450 microlitros de PBS contendo inibidores. Armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Combine as amostras de testículo de 200 oph em um tubo einor de 1,75 mililitro.

Aspire o tampão e reconstitua as amostras em 200 microlitros de tampão de lise. Dissocie completamente o tecido com um homogeneizador azul, garantindo que não restem agregados, e incube à temperatura ambiente por 10 minutos.

Em seguida, fragmente a amostra com um microchip soat, deixe em gelo por 50 segundos. Repita quatro a cinco vezes para obter o tamanho ideal de fragmento para o alvo do chip. Em seguida, dilua com 1,8 mililitros de tampão ripper para obter um estoque de extrato de cromatina. Para um ensaio de chip bem-sucedido, é fundamental determinar empiricamente o tamanho dos fragmentos de DNA.

Portanto, precisamos realizar eletroforese em gel para prosseguir com o experimento em chip. Para a amostra controle de entrada, retire 50 microlitros. Adicione dois microlitros de cloreto de sódio cinco molar e incube a 65 graus Celsius durante a noite.

Para reverter a ligação cruzada, prossiga para conjugação do anticorpo à proteína. Adicione perlas a um tubo fendor de 1,5 mililitro. Adicione 40 microlitros de perlas de proteína A e 600 microlitros de PBS e agite a quatro graus Celsius por dois minutos.

Em seguida, aplique as microesferas ao ímã e descarte o sobrenadante. Agora, adicione 100 microlitros de PBS e também o anticorpo de interesse. Incube em temperatura ambiente por uma hora.

Após colher as microesferas com ímã, adicione um mililitro de extrato de cromatina tecidual. Incube em rotação a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, aplique a amostra de chip a um ímã e remova o sobrenadante.

Prossiga com lavagens de um mililitro das microesferas colhidas a quatro graus SIUs durante dez minutos por cada lavagem, ressuspendendo as microesferas em 100 microlitros de tampão TE. Para reverter os complexos proteína-DNA, adicione três microlitros de SDS a 10% e cinco microlitros de Proteinase K a 20 miligramas por mililitro. Incube a 65 graus Celsius durante a noite.

Centrifugue as microesferas em ímã. Transfira o sobrenadante contendo DNA para um novo tubo. Lave as microesferas uma vez e combine os sobrenadantes contendo o DNA 2D.

Em seguida, purifique o DNA por meio de uma extração com fenol-clorofórmio e transfira a camada aquosa superior para um novo tubo. Precipite o DNA com 20 microgramas por mililitro de acrilamida linear ou glicogênio, 20 microlitros de acetato de sódio três molar e 500 microlitros de etanol 100%.

Homogeneíze bem e incube a menos 80 graus Celsius por 10 minutos. Peliculize o DNA por centrifugação. Descarte o sobrenadante e lave o pellet uma vez com 300 microlitros de etanol 70% após secagem ao ar.

Resuspenda os pellets de DNA em 50 microlitros de tampão TE. Armazene as amostras de DNA fragmentado a menos 20 graus Celsius. Prepare uma diluição seriada de DNA genômico para a curva padrão.

Em uma placa de 96 poços, utilizando modelos de DNA genômico diluído como controle de entrada ou DNA fragmentado, monte uma reação de QPCR de 20 microlitros em duplicata e gire a placa de 96 poços no mini centrifugador de placas. Execute a placa de amostras em um sistema de PCR em tempo real para validar os dados. Primeiro, verifique a presença de um único pico no gráfico de dissociação térmica, indicativo de um único amplicon proveniente da PCR.

Em seguida, construa a curva padrão. Utilizando os dados da série de DNA genômico diluído, calcule a fórmula que determina a quantidade de DNA com base no limiar de ciclo (Ct). Também determine a fase linear da amplificação exponencial da PCR para cada par de primers.

Se o valor de CT das amostras de DNA do chip e dos controles de entrada estiver dentro da faixa linear do valor de CT, calcule o enriquecimento do DNA do chip em relação à entrada levada em consideração. O fator de diluição realiza reparos terminais em 0,1 a cinco microgramas de DNA fragmentado em reações de 50 microlitros contendo polimerase T4 de DNA e quinase de polinucleotídeo T4. Incube por 45 minutos à temperatura ambiente conforme instruções do fabricante.

Em seguida, purifique o DNA utilizando um kit de purificação de reação MinLu. Continue adicionando extensões ao extremo três prima com a DNA polimerase um fragmento grande de CLA NOW e DATP, incubando por 30 minutos a 37 graus Celsius. Novamente, passe a reação por uma coluna de centrifugação para purificar e concentrar o DNA.

Prosseguir com a ligação usando o oligo do adaptador. Misturar a partir da Illumina utilizando T four DNA Ligase e incubar por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, passar a amostra pelo kit de purificação de reação MinElute.

Eluir o DNA em 20 microlitros. Em seguida, separar a amostra de DNA por eletroforese utilizando o aparelho egel. Isolar a faixa de 200 a 400 pares de bases no gel e purificar utilizando o kit de extração de gel KYOGEN.

Agora, amplifique uma biblioteca utilizando primers de extremidade emparelhada, enzimas de fusão HF e pH do programa Illumina por 20 ciclos de PCR. Em seguida, em um gel padrão de 2% AOSE, isole fragmentos de DNA de 200 a 400 pares de bases para sequenciamento de alto rendimento no software de Ellen. Alinhe todas as leituras ao genoma de drosophila, permitindo até dois desencontros com a sequência de referência.

Retenha leituras unicamente mapeadas para análise posterior no caso de múltiplas leituras idênticas. Retenha até três cópias para reduzir a possibilidade de vieses decorrentes da amplificação por PCR. Em seguida, utilize um script em Python para converter a saída do pipeline do GA em arquivos de dados extensíveis para navegadores.

Defina um tamanho de janela de quatro pares de bases e um tamanho de fragmento de DNA de 160 pares de bases. Classifique os genes de drosófila em genes silenciosos e genes expressos por RPKM. Número digital, designe genes com RPKM igual a zero.

Como um grupo silencioso, classifique genes com RPKM maior que um em um grupo expresso com três subgrupos de níveis baixo, moderado e alto de expressão. Por fim, compare os níveis de modificação de histonas e de expressão gênica usando um script Python descrito anteriormente em basal 2007, o bag of marbles. Testículos mutantes apresentam falha na transição de espermatogônias proliferativas para espermatócitos diferenciando.

Este experimento de qPCR em chip utiliza testículos BAM como fonte de células germinativas indiferenciadas para investigar o estado da cromatina de genes-chave necessários para a diferenciação espermática, enriquecimento da modificação da histona, hisstone três lisina 27 metil três ou histona três, lisina quatro, metil três. A expressão dos genes de diferenciação é determinada pela normalização em relação a um gene ciclina expresso constitutivamente. Os genes de diferenciação fator de transcrição específico do macho 87 Don Juan e fuzzy onion, que não são expressos nos testículos BAM, são altamente enriquecidos com a modificação repressora da histona três, lisina 27 metil três.

Além disso, eles são desprovidos da histona ativa. Três, modificação da histona metilada na lisina quatro. Uma assinatura da cromatina que denominamos monovalente, em contraste com a valência que possui tanto a metilação na lisina quatro da histona três quanto a histona três.

Lisina 27 metil três enriquecida em genes de diferenciação em células-tronco embrionárias. Dados de sequenciamento de Chip utilizando o mesmo conjunto de anticorpos. Confirme o resultado de qPCR de Chip mostrado na Figura 1A: regiões genômicas dos três genes de diferenciação terminal testados estão altamente enriquecidas com trimetilação da lisina 27 da histona H3, mas não com trimetilação da lisina 4 da histona H3.

Em contraste, a ciclina do envelhecimento expressa constitutivamente apresenta alta metilação da lisina três da histona quatro trimetilada, mas baixa metilação da lisina 27 da histona três trimetilada próxima ao seu sítio inicial de transcrição. Esta figura mostra dados de ChIP-seq de duas modificações de histonas próximas aos sítios iniciais de transcrição de quatro classes de genes diferencialmente expressos. A metilação da lisina 27 da histona três trimetilada está enriquecida a jusante dos sítios iniciais de transcrição, o que é inversamente correlacionado ao nível de expressão gênica.

Os genes silenciosos exibem o nível mais alto de metilação da lisina 27 da histona três em três, enquanto os genes altamente expressos não mostram ligação da metilação da lisina 27 da histona três, o que é consistente com o papel repressor da metilação da lisina 27 da histona três na expressão gênica. Por outro lado, o enriquecimento da modificação da metilação da lisina quatro da histona três ao redor dos locais de início da transcrição mostrou uma correlação oposta com o nível de expressão gênica, compatível com o papel ativo dessa marcação na expressão gênica.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada corretamente em dois a três dias. Não se esqueça de usar precauções de segurança ao utilizar fenol, clorofórmio e formaldeído. Esperamos que este protocolo tenha fornecido a você uma compreensão suficiente sobre o uso da imunoprecipitação de cromatina para analisar a paisagem da cromatina em tecido in vivo.